康熙二十五年（1686）二月，康熙得知沙俄重新占领雅克萨后，立即命令萨布素速修战舰，统领乌喇、宁古塔官兵2000人，驰赴雅克萨，担当第二次收复雅克萨主力。四月底，又派副都统郎谈、班达尔善等协助萨布素办理军务。康熙特别叮嘱他们，一旦收复雅克萨，一定要在雅克萨驻防设兵，而且不要毁坏城池和附近的庄稼，以便清军长期驻守。
五月，萨布素、郎谈等率军两路进兵，水陆并进，逼近雅克萨。按照康熙的旨意，萨布素再次致书给托尔布津，警告俄军倘若不回本土，必用武力将其消灭。但托尔布津却自恃拥有充足的火炮武器、粮饷弹药，而清军武器简陋，只有少量火器，他依托高城利炮，坚守不降。萨布素此刻却做好了长期作战的准备，为了防止尼布楚方向的俄军增援，清军迅速出兵占领了黑龙江上游，截断了俄军的增援之路。随后，清军开始发动猛攻，经过数日激战，打死俄军百余名，其头目托尔布津也被清军杀死。但俄军凭借其城坚固，仍然据城固守。
萨布素遵照康熙旨意，决定避开攻坚，准备进行长期围困，因此，清军便于雅克萨城下，修筑工事，周密部署了长期围困敌人的军事设施。并在城西对面的古城岛上筑起指挥所和过冬营寨，炮位直接对准雅克萨，封锁了江面，东西两岸分别驻扎水师，严防敌人逃跑。在清军的长期围困下，雅克萨城里的俄军弹尽粮绝，饥寒交迫，加上疾病流行，造成死者无数。近千名俄军到最后只剩下了一百五十余人，而且大多患病，能站岗放哨的就只有30名士兵和15名青少年，加上尼布楚的俄军又无法增援，雅克萨已是万般困顿。此时，沙俄政府见清廷收复失地的坚决态度，雅克萨大势已去，为避免重镇尼布楚再受到冲击，迫不得已才向清廷求和。
用武力抗击沙俄侵略是康熙皇帝为维护国家主权而不得已采取的行动，他是一贯主张和平的。但沙俄把康熙皇帝不愿动兵看作是不敢动兵，对康熙皇帝的多次和平谈判要求置之不理。康熙皇帝第二次用兵收复雅克萨之后，仍然致书沙皇，要求俄国迅速撤兵雅克萨，派使团前来进行和平谈判。当时，沙俄内部也陷入巨大的危机之中，沙皇阿列克赛病逝，其弟约翰和彼得一起被立为沙皇，但大权掌握在其姐索菲娅公主手中，姐弟之间为了争权夺利，矛盾不断，政局也十分不稳定，而且当时俄国正集中力量争夺波罗的海和黑海的控制权，没有多余的兵力增援雅克萨。在这样的形势下，沙俄才答应清朝政府的建议，派文纽科夫、法沃罗夫为使者，前来中国商议和谈。文纽科夫、法沃罗夫于康熙二十五年（1686）九月二十五日到达北京，康熙派出大学士明珠、尚书科尔昆、佛伦等与之谈判，表现出了清政府的重视。俄使首先提出，清军应先行解除对雅克萨的围困，待戈洛文使团来华后，再谈判和解决边界问题。本着对和平解决问题的诚意，康熙答应了俄使这一请求，当即下令萨布素撤围，并额外准许俄兵自由出入雅克萨城。得到康熙的命令后，当地清军还救济俄军粮食，允许患病的俄兵就医。康熙二十六年（1687）春，清军已经完全停止了对雅克萨的封锁。
然而，沙俄做出求和的决定，只是无奈之举，雅克萨的俄军已濒临绝境，继续使用武力侵占黑龙江地区的图谋已不能得逞，为了摆脱雅克萨俄军覆灭的厄运，沙俄被迫接受了康熙皇帝和平谈判的要求，但并没有放弃对中国领土的欲望。康熙二十五年（1686）正月，沙俄政府任命戈洛文为对华谈判的全权大使，率领官吏士兵共计一千九百余人的庞大队伍前来中国谈判。沙皇政府指示戈洛文，在谈判中要力争以黑龙江为两国边界，如果这个要求达不到，以牛满河、精奇里江为界也可；如果这个要求也达成不了，则以雅克萨为界，但应使清政府答应在牛满河和精奇里河江保留两国共同的渔猎场。如果这些要求都没达到，戈洛文就可以调动俄在西伯利亚的军队，出兵和清朝作战。总之，就是要最大限度地获取利益。
在这期间，沙俄企图利用噶尔丹的叛乱达到俄国的利益最大化，因此不断拖延时间，俄国使团不断挑唆蒙古各部之间的矛盾，但事情却并不按照俄国人的设想发展。蒙古各部纷纷要求中央政府出面，解决噶尔丹问题，以维护国家的主权完整。
一直到康熙二十八年（1689）七月八日，中俄双方才正式在尼布楚开始会谈。谈判过程中，俄国使团为了夺取更多的领土，将沙皇政府事先制定的三个方案先后抛出，并将战争的责任全部推卸到中方的身上，污蔑中国侵犯了沙俄的领土。清方的全权大臣索额图根据康熙的指示，据理力争，有力地反驳了沙俄的信口雌黄。经过反复的磋商和较量，双方终于在康熙二十八年七月二十四日（1689年9月7日）达成协议，签订了《中俄尼布楚条约》。条约的主要内容有：
一、中俄两国以格尔必齐河、额尔古纳河至外兴安岭为两国东段边界，以南归中国，以北归俄国。中段边界暂行有效，留待以后再议。
二、俄人应拆除在雅克萨所建建筑，俄国居民携带其用物，退回俄国境内，两国人等，不得擅越边界。
三、互不收纳逃人，如有逃人，双方均应遣返。
四、已在中俄两国定居的双方居民，应维持现状。
五、自和约签订之日起，双方居民持有护照者，可以过界往来，并可以贸易互市。
六、双方均应严守条约，避免争端。条约最后以满、俄、拉丁三种文字刻在石碑上，置于两国边界，作为永久纪念。
《尼布楚条约》签订之后，清政府在当地建立起了健全的管理机构，以加强对边界地区的管理。分别在盛京、宁古塔、黑龙江设立将军，并在黑龙江的各个战略要地设立管理机构，同样派兵驻防。清政府还继续推行永戍政策，还发展了东北地区各少数民族与内地之间的产品交易市场，为维护统一的多民族的中国做出了贡献。这些措施，极大促进了东北地区的发展和繁荣。
中俄《尼布楚条约》是中俄两国正式签订的第一个条约，对双方均产生了重要影响。对中国来说，条约的签订制止了沙俄在黑龙江地区的武力扩张，一举收回了长期被沙俄霸占的中国领土雅克萨，更重要的是，条约以法律的形式确定了中俄两国的东段边界，使东北边疆地区在此后相当长的时期内获得了和平。对俄国来说，签订合约后，中俄的边境贸易大为发展，使沙俄得到了巨大的好处。
不得不说的是，《尼布楚条约》虽是两国平等协商的结果，清政府还是在《尼布楚条约》中作出了重大让步。但从全局来看，清政府以局部利益换取了统一北疆的全局利益，使统一的多民族国家得到进一步发展。在抗俄的斗争中，康熙皇帝提出一系列经营和开发东北地区的重要措施，使东北边境地区的经济和军事力量都得到进一步的加强，为东北地区的繁荣和发展作出了重要贡献。
