免疫组织化学技术，它的目的在于用已标记的特异性抗体？穴或抗原）对组织内抗原？穴或抗体）进行探测或了解其分布以进行定位等。这项技术非常敏感，用很微量的抗体即可测出存在于组织内少量的相对应抗原成分。免疫组织化学的方法很多，市面上又有很多商品化试剂以及成套药盒出售。本章目的在于实用，重点介绍临床病理诊断及常用的几种具有代表性的染色方法。
免疫组织化学染色过程中的注意事项：
1．消除非特异性反应引起非特异性染色的原因主要
是带电荷组织成分，如结缔组织和内源性过氧化物酶，如红细胞等。前者消除的办法是采用与第二抗体免疫动物相同动物的正常血清孵化，使之阻断第二抗体与带电荷组织成分结合，后者的消除办法是0．3％过氧化氢甲醇液封闭内源性过氧化物酶。
2．组织的固定最好是采用10％中性缓冲福尔马林液。组织必须充分固定，但过度的固定往往会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响第一抗体和抗原的结合。在进行染色前，可采用蛋白酶来消化，以暴露抗原部位。
3．组织处理为了适合免疫组织化学染色，常规石蜡包埋过程的温度不应该超过60℃，因为过高的温度易损害组织中的抗原和组织形态结构。此外脱蜡必须彻底？熏否则会造成非特异性着色或不着色。
4．切片涂胶因为组织切片长时间在水中反复漂洗操作，加之用酶消化，使组织很容易脱落，所以建议在切片前先在玻片上涂胶。目前在国外，可以购置商品化专用胶，如：Histostlk和Elmer’s。国内可用家具白乳胶（用时稀释）及自己配制黏固剂（详见后面配方）。无论是涂商品胶还是自制胶，在涂胶前一定要用肥皂水或洗液将切片洗净，放在无尘处风干。
5．抗体浓度免疫组织化学染色要受到很多方面的影
响，如抗体的稀释度过高过低都可造成假阳性或假阴性结果，此外标本的处理方法也影响抗体的稀释浓度，如组织固定液的选择、包埋处理过程，甚至缓冲液的选择、染色温度、染色湿度和染色时间等都有影响。因此，每个实验室应根据自己的情况逐一摸索，力求找到一个最佳条件，一般是根据生产厂家推荐的工作浓度范围，设立几种稀释浓度，另外选择一张阴性对照片。
6．对照组的选择每一次染色都应该选择阴性对照片和阳性对照片。阴性对照是采用不含靶抗原的组织切片。而阳性对照片则是采用含有已知靶抗原，并且以前已用相应抗体染色，并显示有明显的阳性结果的切片，因而对一个未知的患者标本进行检测，需同时染四张切片，这样才能保证诊断结果的准确性。
一、免疫组化常见试剂配方
（一）缓冲液
1．0．01摩尔磷酸缓冲液（PBS液）（pH值为7．2～7．4）
（见第15章）
注意：工作液存放不宜超过两周。
2．Tris缓冲液（见第15章）
3．醋酸缓冲液
醋酸贮存液
A液：0．2摩尔醋酸液
醋酸11．5毫升
蒸馏水1000毫升
B液：0．2摩尔醋酸钠液
醋酸钠27．2克
蒸馏水1000毫升
冰箱内保存。
醋酸缓冲工作液
1份A液＋3份B液，pH值为5．0。
酶底物工作液
1份醋酸缓冲工作液加1份蒸馏水，使之成为0．1摩尔工作液，备用作AEC显色时用。
（二）酶作用底物的配制方法
1．3－氨基9－乙基咔唑（3－amino－9－ethyl－ear－bazole，简称AEC）
AEC10毫克
N，N－二甲基甲酰胺 2．5毫升
0．1摩尔醋酸缓冲液50毫升
30％双氧水 10滴（约0．2毫升）
使用时现配，摇匀，过滤后使用。
2．3，3－四盐酸二氨基联苯胺（3．3－dlaminobenzidine
tctrahydrochloride，简称DAB）：
DAB25毫克
0．05摩尔Tris缓冲液pH7．650毫升
30％双氧水0．15毫升
摇匀过滤后立即使用。
注意上述酶作用底物，尤其是DAB为一种致癌物，应集中收集后，加以特别处理，切忌倒入水槽内。
（三）复染用Harris苏木素溶液的配制
AEC显色的切片，不能用酒精处理，因阳性柠红色产物能溶于酒精中，故宜用不含酒精的苏木素染液。
（四）封固剂的配制
酶作用底物为DAB时，可用常规石蜡切片的脱水、透明和封固方法，而AEC因不能用酒精脱水，需用水溶性封固剂，如甘油明胶和聚乙烯醇等。
甘油明胶封固剂
明胶 10克
蒸馏水 80毫升
甘油 70毫升
酚（结晶） 0．25克
先用蒸馏水煮沸溶解明胶，后加甘油和酚，用前加热溶解。
聚乙烯醇封固剂
聚乙烯醇 20克
PBS（pH 7．2）80毫升
甘油 40毫升
先用溶于PBS液中的聚乙烯醇加热至70℃溶化，并搅拌，再加入甘油。
（五）载玻片涂黏固剂法
由于免疫组化染色的过程较长，尤其是PAP和ABC法等步骤多，水洗时间长，组织切片容易从载玻片上脱落，故我们推荐两种自制黏固剂。
1．铬矾明胶液
铬矾 0．5克
明胶 5克
蒸馏水 1000毫升
加热，搅拌均匀，如仍有残渣可用滤纸将未溶残渣刮出。
2．甲醛—明胶液
40％甲醛2．5毫升
明胶 0．5克
蒸馏水 至100毫升
先加少量水在明胶中，加热至溶化后倒入甲醛液，补加蒸馏水至100毫升。
涂胶操作步骤：
（1）将用肥皂水或洗液洗净阴干的切片放在切片架上；
（2）置切片架于明胶溶液中1～2分钟，取出；
（3）置切片架于无尘处阴干或烤箱中烤干；
（4）切片收存盒内备用。
（六）蛋白消化酶的配制
1．胰蛋白酶消化液
纯化胰蛋白酶100毫克
氯化钙13．4毫克
蒸馏水100毫升
使用前，先将氯化钙液用1摩尔HCL或1摩尔NaOH调pH值至7．8，加温至37℃。使用前现将胰蛋白酶加入预热的氯化钙液中。
2．0．1％链霉蛋白酶消化液
链霉蛋白酶100毫克
0．5摩尔Tris缓冲液（pH 7．5） 100毫升
使用前先将链霉蛋白酶倒入预热37℃的Tris缓冲液中。
3．胃蛋白酶消化液
胃蛋白酶400毫克
0．01摩尔盐酸溶液100毫升
处理方法同上。
二、几种常见免疫组化染色法
（一）免疫荧光染色法
1．直接法
（1）组织冰冻切片4微米左右，载玻片应预先涂以黏固胶；
（2）切片可置于盒内，包以塑料，存放于－20℃～－70℃冷冻冰箱内，可存放达数月之久。如需要立即染色，则用电吹风空气干燥20分钟；
（3）染色前，取出切片，放置室温中，干燥10分钟；
（4）切片经丙酮固定5～10分钟；
（5）PBS液洗3次，每次5分钟；
（6）滴加稀释的荧光标记抗体于组织切片上；
（7）置湿盒中孵育30分钟；
（8）PBS洗4次，每次5分钟，可用电动振荡器，以助洗净未结合的抗体；
（9）拭干组织周围的水，10％缓冲甘油封固，加盖玻片；
（10）保存于冰箱内，待荧光显微镜检查。
2．间接法
（1）～（5）步骤同直接法；
（6）滴加未标记的第一抗体，置湿盒中，室温或37℃孵箱内30分钟；
（7）PBS洗4次，每次5分钟；
（8）滴加荧光标记抗体（第二抗体）置湿盒中，室温或37℃孵箱内30分钟；
（9）PBS洗4次，每次5分钟；
（10）封固待检同上。
结果：根据标记物不同阳性信号可呈红色、黄色或绿色。
（二）免疫酶组织化学染色法
1．固定10％中性缓冲福尔马林，冰冻切片、涂片和印片空气干燥。
2．切片石蜡切片和冰冻切片，4～6微米。
3．步骤
（1）直接法
1）石蜡切片，置60℃烤箱内1小时，再用二甲苯脱蜡3次，每次5分钟，无水酒精洗2次；冰冻切片，放置室温下干燥10分钟，进丙酮液内固定5～10分钟或95％酒精中，10～30分钟；
2）石蜡切片置于新鲜配制的0．3％过氧化氢甲醇液30分钟，以减少内源性过氧化酶活性，冰冻切片改用3％过氧化氨水溶液约3～10分钟；
3）PBS洗3次，每次5分钟；
4）滴加稀释的过氧化酶结合抗体，置湿盒内60分钟；
5）PBS洗3次，每次5分钟；
6）用新鲜配制的酶作用底物液（DAB或AEC）在显微镜控制下显色；
7）自来水或4％甲醛液终止显色，自来水冲洗；
8）苏木素复染（不宜过深）；
9）AEC显色片用甘油明胶封片，DAB显色用常规石蜡切片封固法。
（2）间接法
1）～3）两步操作同直接法；
4）滴1∶10稀释的正常动物血清（与第二抗相同的动物血清）置湿盒内30分钟，直接进行下一步，切忌冲洗，仅需要倾去多余的血清；
5）滴加稀释的第一抗体，置湿盒内1小时；
6）PBS洗3次，每次5分钟；
7）滴加稀释的过氧化酶标记的第二抗体。置湿盒内1小时；
8）PBS洗3次，每次5分钟；
9）余同直接法（6）～（9）步。
4．结果
阳性结果DAB棕黄色
AEC 棕红色
（三）PAP法
1．固定10％中性缓冲福尔马林，冰冻切片、涂片和印片空气干燥。
2．切片石蜡切片和冰冻切片，4～6微米。
3．步骤
（1）石蜡切片，应先在60℃孵箱中加温1小时，再用二甲苯脱蜡3次，每次5分钟，无水酒精洗2次，每次5分钟。冰冻切片步骤同直接荧光法（1）～（5）步骤处理；
（2）置石蜡切片于新鲜配制的0．3％过氧化氢甲醇液中30分钟。冰冻切片用3％过氧化氢水溶液处理3～10分钟；
（3）石蜡切片，根据抗体说明书要求，有些切片需经蛋白酶消化处理，以消除甲醛固定所致的掩篇作用。孵箱内15～30分钟；
（4）PBS洗3次，每次5分钟；
（5）滴加1∶10稀释的正常血清置湿盒内，37℃10分钟，直接进行下一步，切忌冲洗；
（6）滴加稀释的第一抗体，37℃1小时，高度稀释之抗体亦可放于4℃冰箱过夜；
（7）PBS洗3次，每次5分钟；
（8）滴加非标记第二抗体，置湿盒内37℃，30分钟；
（9）PBS洗3次，每次5分钟；
（10）滴加PAP，置湿盒内，37℃，30分钟至1小时；
（11）PBS洗3次，每次5分钟；
（12）新鲜配制的酶作用底物，光镜控制下显色；
（13）同酶标直接法（7）～（9）步。
4．结果同酶标直接法。
（四）ABC法
1．固定10％中性缓冲福尔马林，冰冻切片、涂片和印片空气干燥。
2．切片石蜡切片和冰冻切片，4～6微米。
3．步骤
（1）～（7）各步骤同PAP法；
（8）滴加生物素标记的第二抗体，置湿盒内，37℃，30分钟；
（9）PBS洗3次，每次5分钟；
（10）滴加卵白素—生物素过氧化酶复合物（ABC），湿盒内，37℃，30分钟；
（11）PBS洗3次，每次5分钟；
（12）新鲜配制的酶作用底物，光镜控制下显色；
（13）同酶标直接法（7）～（9）步。
4．结果同酶标直接法。
（五）AB PAP法
1．固定10％中性缓冲福尔马林。冰冻切片、涂片和印片空气干燥。
2．切片石蜡切片和冰冻切片，4～6微米。
3．步骤
（1）～（7）各步骤同PAP法；
（8）滴加生物素标记的第二抗体置湿盒内，37℃，30分钟；
（9）PBS洗3次，每次5分钟；
（10）滴加PAP置湿盒内，37℃，30分钟；
（11）PBS洗3次，每次5分钟；
（12）滴加卵白素—生物素过氧化酶复合物（ABC）置湿盘内，37℃，30分钟；
（13）PBS洗3次，每次5分钟；
（14）新鲜配制的酶作用底物，光镜控制显色；
（15）同酶标直接法（7）～（9）步。
