三、细胞培养中常见问题及其处理
1.利用抗生素消除细胞中的污染当一个重要的无法取代的组织细胞被污染后，研究人员要想方设法控制或消除污染。首先应清楚污染物是细菌、真菌、酵母菌还是支原体，然后有针对性地选用消毒工作环境、培养箱的消毒剂和细胞培养用的抗生素。抗生素的浓度过高对某些细胞会产生毒性，所以，在使用抗生素消除污染物之前，要进行药物安全剂量试验，以测定出某一种抗生素对某一种细胞的毒性剂量。特别是两性霉素B和泰乐菌素。测定毒性剂量和消除细胞中的污染物的方法如下：
1.1用无抗生素的细胞生长液分散、稀释细胞，将细胞稀释至正常细胞传代的浓度。
1.2将细胞悬液加至细胞培养板的各个孔中（或几个培养瓶），按梯度浓度将选择的抗生素加到各个细胞孔中。比如两性霉素B可按0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0ug/ml的量分别加入各细胞孔中。
1.3每日观察对细胞的毒性作用，比如细胞脱落、出现空泡或生长减慢等
1.4当抗生素剂量测定后，以低于毒性剂量1～2倍的剂量加入细胞生长液中，用这种抗生素细胞生长液将细胞培养2～3代。之后再用无抗生素的细胞生长液培养传代至4～6代，以观察污染是否被去除。
2.细胞的保存与复苏
2.1细胞短期保存：细胞单层长满后，更换新细胞生长液，置于比该细胞最适生长温度低5～8℃下保存，可存放1～4周（根据不同细胞而定）。细胞单层长满后，更换新细胞生长液，静置于4℃，可存放2～6周（根据不同细胞而定）。经过以上存放的细胞会有部分细胞死亡，一般通过二代传代培养，可恢复细胞的正常生长状态。
2.2细胞的长期保存：用Versene胰蛋白酶溶液按常规消化细胞单层，离心收集细胞2次（500r/min，10min）。将沉淀的细胞通过离心管上的刻度定其容量，按每0.5ml沉淀细胞加8.5ml细胞生长液和lml二甲基亚砜（DMSO）的比例，将三者混匀，每lml分装1只安瓿。将安瓿集中放在盒中，分以下三步缓慢降温。置4℃2h。置-20℃2h或至安瓿中的液体冻结为止。置-70℃2h超低温冰箱或液氮中，放在液氮中可保存数年。
2.3从冷冻状态复苏细胞。要迅速解冻，取出安瓿后立即投入37℃水浴中。这一过程应做好人身防护，因为安瓿有时会炸开。用70％酒精浸泡消毒，然后打开安瓿，将细胞悬液转入离心管中，补加细胞生长液，以500r/min离心10min去掉DMSO。这一过程要快，因为DMSO在室温下对细胞有毒性。加细胞生长液使细胞浓度由保存时期的5％变为0.2％。分装于培养瓶中，分装量因培养瓶不同而不同。贴壁后（通常约24h），轻轻倾出旧液，换新的细胞生长液继续培养。
四、利用动物细胞培养分离病毒
自从人们发现能够利用动物细胞复制脊髓灰质炎病毒以来，细胞培养物已成为分离病毒最简便、应用最广泛的一种方法。由于不同的病毒适应的细胞不同，所产生的细胞病变也不同，所以，这里介绍一般制备方法。
1.选择刚刚长满的细胞单层（36h内长满80％以上单层），要求无污染，形态正常。
2.弃细胞生长液，每个细胞瓶（或管、或孔）加入样品溶液，以浸没细胞单层为宜。置37℃吸附60min，若样品溶液很少不能浸没细胞单层时，可将细胞瓶置于摇床上，缓慢摇动，使样品不断浸润全部细胞单层。
3.补加5倍或10倍于样品溶液的细胞维持液（其中犊牛血清要保证不含某种特异性病毒抗体或不加血清），于37℃培育。对毒性物质含量较高的样品（如粪便样品），加维持液之前可将样品溶液去掉。
4.每天观察细胞病变（CPE），发生CPE时，再接种另一批同样的细胞培养物，以获得更充足的鉴定材料。CPE的判定一定要以健康对照细胞成立为前提。
5.对48h或72h（其他病毒依照CPE出现时间而定，通常在7d以内）仍不出现CPE的细胞瓶，将其冻融一次，用其收获液按上述方法盲传2～3代，若仍不出现CPE，视为阴性。但必要时要继续传代。
注：吸附过程是必要的，特别是分离病毒初代接种，可提高分离病毒的效果。当病毒含量很少时，若不经吸附直接加人细胞维持液，等于稀释病毒，减少病毒与质膜的结合几率，这样即使有病毒也可能不产生CPE，从而被误认为是病毒阴性。
第四节病毒的鉴定
一、病毒核酸型的测定
1.卤化核苷酸法当氟脱氧尿核苷（FUDR）或溴脱氧尿核苷（BUDR）或碘脱氧尿核苷（IUDR）结合到病毒的DNA中去，使其遗传性遭受破坏。它们是核酸代谢抑制剂，当其浓度达到10-5mol/L时，DNA病毒的复制就被抑制，而绝大多数RNA病毒不受影响，只有反录病毒例外，因为它们的繁殖早期需要DNA的合成。
试验方法：当细胞培养长成单层后倒掉营养液，换以含FUDR（或其他卤化核苷酸）50ug/ml的新营养液，置37℃培养过夜。倾去细胞营养液，用Hank’s液洗1次，然后接种连续10倍稀释已知病毒和待检病毒悬液，每一稀释度接种4管，于室温或37℃吸附lh后加入新营养液。含FUDR 50ug/ml和不含抑制的营养液各2管。置37℃培养，每天检查细胞病变（CPE）。对不产生CPE的病毒则用其他指标检查。
结果判定：当正常营养液管的CPE已经明显，各对照管即RNA病毒对照管不被抑制，DNA病毒对照管有明显抑制，空白细胞培养生长正常时即可进行判定。含抑制剂的病毒滴度低于对照管超过2个滴度时即可判为DNA病毒，否则为RNA病毒。
注意事项：代谢抑制剂对细胞有一定毒性，在使用前要测定细胞对它的耐受力，以消除非特异性抑制效应。在维持液中不应含有胸腺嘧啶核苷（与抑制剂是同功异质体），最好用Eagle氏MEM，不要用199或1640等复杂综合营养液。试验必须设置已知RNA和DNA病毒对照和不接种病毒的空白细胞培养对照。
2.放线菌素D（Actinomycin D）法放线菌素D是一种多肽类抗生素，能与细胞和病毒的DNA结合，抑制依赖于DNA的RNA合成，但不抑制依赖于RNA的RNA的合成，因此它可以区分DNA和RNA两类病毒，DNA被抑制可达95％，RNA则不受影响。但有3类RNA病毒，即呼肠孤病毒、正黏病毒和反录病毒例外，它们对放线菌素D敏感。
试验方法：首先用细胞培养测定细胞对放线菌素D的耐受浓度（10、1.0、0.1ug/m1）。然后配制含测定浓度的放线菌素D的细胞营养液（放线菌素D一般为5～10ug/m1）。将待检病毒和已知对照病毒（DNA和RNA病毒）作连续10倍稀释，每一稀释度各接种4管细胞培养，置室温或37℃吸附1h。一半细胞培养管加入含放线菌素D的营养液，另一半加正常营养液。置37℃培养，每天观察CPE。
结果判定：当不含放线菌素D营养液的细胞管中CPE已经明显，RNA病毒对照管不被抑制，DNA对照管明显抑制和不接毒的细胞培养对照生长正常时即可判定结果。待检病毒被抑制超过2个滴度者即为DNA病毒。
3.吖啶橙（acridine orange，AO）染色法AO染色法可以测定核酸的股数。AO是一种荧光染料，在适宜条件下AO染料能与单股核酸结合，结核染料的单股核酸分子的吸收光波从原来游离染料的490nm转移到465nm，则在紫外线照射下发出红色荧光。当染料与双股核酸相遇时，结合的量甚微且容易解离，吸收光波从490nm转移到502nm而发生绿色荧光。
3.1试验用溶液的配制
3.1.1Carnoy氏固定液：冰醋酸1份，无水酒精6份，氯仿3份。
3.1.2Mcllvaine氏缓冲液：0.1M枸橼酸12.9ml、0.2M Na2HOP047.1ml。
3.1.30.01％吖啶橙染液：吖啶橙10mg溶于Mcllvaine氏缓冲液100ml中，装棕色玻瓶，冰箱贮存。
3.2试验步骤：将组织触片、冰冻切片或细胞培养的盖玻片在Camoy氏液中固定5～10min。再于Mcllvaine氏液中放置5～10min。取出放于AO染液中染色5min后用Mcllvaine氏液漂洗2—3min。然后在载玻片上滴1滴Mcllvaine氏液，加盖玻片（如为盖玻片细胞培养则将细胞单层向下），用450nm光波（高压汞灯加蓝紫色泸光片）在荧光显微镜下观察。
3.3结果判定：正常细胞核呈黄绿色，核仁橘黄色，细胞浆暗红色。感染细胞的核中双股DNA病毒呈黄绿色荧光小颗粒，包涵体可能呈不同形状。在细胞浆繁殖的双股DNA或双股RNA病毒在红色背景中发生黄绿色荧光，单股RNA病毒发生出鲜红色荧光。
4.注意事项
4.1用固定液固定的目的是使细胞膜的通透性增强，本试验常用的Carnoy固定液效果良好，不能用含有苦味酸或镍酸的固定液，因其可使荧光强度降低。
4.2吖啶橙易于核糖体的单股RNA结合，发出红色荧光，而某些病毒的CPE常对核糖体有影响，故于检查时注意区分。
4.3当AO溶液浓度超过0.05％，pH高于6.0时，整个细胞发生红色荧光。因此AO适宜浓度为不超过0.01％，适宜的pH为3.6～5.2。
4.4在染色过程中，染色液必须新配，染色时间不能过久，漂洗液最好使用Mcllvaine氏缓冲液而不用PB。
二、病毒理化特性测定
1.热敏感性试验有些病毒对热敏感，在50℃经30min可被灭活，但其敏感性受营养液中某些物质的浓度影响，因此在试验中的条件要一致。
方法：将病毒悬液2ml加于试管中，置50℃水浴中30min，以同样的病毒悬液置4℃30min作为对照。然后将试验组和对照组的病毒液分别作10倍连续稀释，每一稀释度接种4管细胞进行培养，滴定TCID50。加热处理的病毒悬液的感染力如比对照悬液低2.0Log以上则认为该病毒对热敏感。
