耐吡嗪酰胺与pncA突变
吡嗪酰胺（Pyrazinamide，PZA）是一种烟酰胺类似物，只对结核菌有效，为第一线抗结核药物。PZA是半休眠分枝杆菌的杀菌剂，因而可缩短抗结核疗程。其最低抑菌浓度（MIC）受培养基PH值影响，作用机制尚不十分清楚。PZA可能是一种具有抗分枝杆菌活性的复合物（吡嗪酸）的前体，靶标可能是脂肪酸合成酶系。PZA在体内由吡嗪酰胺酶转换为活性形式吡嗪酸而发挥作用。吡嗪酸靶酶PZA对pH要求很高，仅在细胞内PH值约等于5.5时，吡嗪酸才在细胞内积累，同时由于体内不足的外排系统，吡嗪酸在细菌细胞质中浓度很高。吡嗪酸的积累又反过来使细胞内PH值降低，抑制了脂肪酸合成酶系中吡嗪酸靶酶的活性，从而实现杀菌作用。
目前的研究表明，结核分枝杆菌耐PZA与吡嗪酰胺酶编码基因pncA突变，使吡嗪酰胺酶活性降低或消失，而不能将PZA转变为活性型有关。pncA基因全长561bp，编码186个氨基酸的蛋白质。Scorpio等[62]为了进一步探明PZA耐药的分子机理，克隆了编码吡嗪酰胺酶的基因。对4株PZA临床分离株的pncA基因进行测序，发现3株存在密码子63、138、141错义突变，另一株162位缺失。这些菌株均丧失了吡嗪酰胺酶活性，而敏感株均未有pncA改变。将pncA野生型转入PZA耐药株，可使它重新获得吡嗪酰胺酶活性并对PZA敏感。结核分枝杆菌耐PZA分离株pncA突变分布广泛，现已发现20多个位点突变，大多数为点突变，少数为插入或缺失突变，其中发生率较高的是47位Thr→Ala、85位Leu→Pro和70位G缺失。
耐喹诺酮类药物与gyrA和gyrB基因突变
喹诺酮类药物是一类人工化学合成抗菌药，由于该类药物均具有4－喹诺酮母核的基本结构，故由此命名。到第三代产品喹诺酮类药物，因其在喹诺酮母核的第六位上引入氟，第七位上引入哌嗪基或吡咯啉基的衍生物，故亦称氟喹诺酮类（Fluoroquinolones，FQ）。主要包括环丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星等。作为最主要的二线抗结核药，FQ与其他抗结核药物联用在结核病，特别是耐药结核病的临床治疗上取得一定的疗效。但随着FQ在抗结核治疗中的广泛应用，喹诺酮类物耐药菌株也急剧增加。
喹诺酮类药物的主要作用靶位是DNA解旋酶。喹诺酮类药物是DNA旋转酶A亚单位的抑制剂，通过形成药物－DNA－酶复合物而抑制DNA旋转酶的活性，在DNA复制水平上阻断菌体代谢，使超螺旋结构松弛，双链不能被部分地拆开，DNA复制停止，导致菌细胞死亡。DNA旋转酶为一种Ⅱ类拓扑异构酶，由gyrA和gyrB基因编码的A和B两种亚基组成，两个A亚单位和两个B亚单位分子组成四聚体，A亚单位具有促进DNA链的切断、再结合和超螺旋化活性；B亚单位具有腺苷三磷酸酶活性，催化腺苷三磷酸（ATP）水解，为DNA链切断、再结合与超螺旋化提供所需的能量。gyrA基因长2517bp，位于长度为2060bp的gyrB基因的下游，两者相距36bp。
到目前为止，发现在耐FQ类药物的各种细菌（如结核杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌等）中，几乎所有突变都发生在gyrA基因内67～106位密码子（相应大肠杆菌编码系统）的保守区，这个区域被称为氟喹诺酮类药物的耐药决定区（QRDR），该区域内碱基突变导致了菌体解旋酶A亚基与氟喹诺酮类药物结合区结构改变，抑制了二者结合而导致耐药。通过对gyrA 120bp的QRDR及gyrB117bp的QRDR的序列分别进行分析，结果显示分枝杆菌与其他细菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、链球菌等）的同源性为57％～70％（gyrA）和69％～82％（gyrB），而分枝杆菌属各种之间的同源性均为98％－100％。个别碱基的差异所致的gyrA83位丝氨酸→丙氨酸或苯丙氨酸，gyrB 447位赖氨酸→精氨酸，464位丝氨酸→天冬酰胺的转化，均处于不同菌株对喹喏酮耐药与敏感的关键氨基酸上。不同菌种之间存在的QRDR区位点多态性导致了不同菌种对FQ的MIC值的不同，这也进一步支持了DNA旋转酶A亚单位的QRDR的变异与结核杆菌对喹诺酮的耐药有关。分枝杆菌属DNA旋转酶A亚单位QRDR区域的差异主要表现在83位密码子上。应用DNA旋转酶的晶体衍射技术，发现DNA旋转酶的gyrA83位氨基酸恰好处于DNA和喹喏酮结合部位，因而该部位的氨基酸的替换，可影响与喹喏酮的结合，导致耐药的发生。
耐多药结核病的分子基础
耐多药结核病（MDR-TB）的发生已对当前结核病防治构成严重的威胁。当代结核病学中耐多药是指结核杆菌分离株同时对INH、RFP这两种或以上的抗结核药物耐药，即至少对抗结核药物中INH和RFP产生耐药的结核病。大多数的耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变累积所致，出现的几率是耐各个单药出现几率的乘积。所以染色体上多个相互独立基因自发突变的逐步累加是产生耐多药结核病的分子基础。
综上所述，随着分子生物学的迅猛发展及在结核病学中的应用，通过最近10多年的研究积累，对抗结核一线药物和主要的二线药物的作用机制研究已取得很大进展。迄今为止，结核杆菌中未发现质粒和质粒介导的耐药性。因此，染色体突变介导的耐药性是结核杆菌产生耐药的主要方式。由于靶基因核苷酸的突变，导致氨基酸置换，影响了药物和靶位点的亲和性，形成结核杆菌对药物的敏感性下降或耐受。目前，结核杆菌耐药机制的研究成果，对于深入了解药物敏感性、耐药水平，对同类药物的交叉耐药性及对菌株毒力已产生巨大影响，也将对建立全新的快速耐药检测方法，并对指导临床用药起到了重要作用。但由于结核药物耐药机制的复杂性，仍有许多问题亟待阐明：①综合分析目前全球不同来源的结核杆菌耐药分离株的研究结果，这些分离株的药物靶基因及其突变部位、性质无明显的地理差别，说明结核杆菌基因组相当稳定，进化变异缓慢。但由于耐药株在局部播散的结果，地理差异会影响某些突变的发生率。因此，进一步对耐药基因不同位点突变分布频率的研究，有助于结核分枝杆菌耐药的流行病学调查。②除目前已知的结核杆菌耐药基因外，是否尚有其他耐药基因存在并发挥作用；是否还存在已知耐药基因的耐药决定区以外的突变。③多数已知药物的耐药突变位点与耐药水平间的关系有待进一步探讨。④结核分枝杆菌耐药是否与外膜通透性降低和主动外排引起药物在细胞内蓄积减少的机制有关。⑤除RFP和PZA外，其他药物的耐药性不仅仅是单一基因的改变所致，而往往需要多个基因突变的共同参与，这些耐药相关基因之间的是否存在相互关联。⑥目前在实验室建立的RFP、INH等重要一线药物耐药基因快速检测方法建立及质控标准化、规范化问题。上述问题的解决将对今后建立快速、简便、准确的结核杆菌耐药基因检测方法，寻找高度特异、疗效确切的抗菌药物，对耐药结核病提供及时和有效治疗具有深远的意义。
