第一节 痰液脱落细胞病理学检查
一、目的
痰液脱落细胞病理学检查主要是通过检查痰液中脱落细胞的形态学改变来检查呼吸道及肺部病变的一种细胞病理学方法。检查具有非损伤性、非介入性且经济、方便、特异性高等优点，与其他部位的细胞病理学检查不同的是痰液细胞病理学主要是检查恶性肿瘤细胞（癌细胞），而对癌前病变检查无意义。
痰液脱落细胞病理学检查的敏感性与特异性有赖于多环节的质量控制，如标本留取、送检、制片、镜检等，在严格的质量控制下，痰液检查原发性肺癌的敏感性可达到60%～80%，特异性达到100%，因此已作为确诊肺癌的重要手段。
二、方法学
（一）标本准备
1.咳痰
（1）建议用晨痰，涮牙、嗽口后进行深咳采痰。
（2）有条件者可采用雾化吸入后诱咳采痰。
（3）纤维支气管镜检后咳取痰液能提高阳性率。
2.采集
（1）一次咳痰建议留取3～5口痰液。
（2）存放标本的容器必须是无吸水性的干燥塑料或玻璃器皿，须加盖密封，标签应记录相关内容，包括姓名、门诊号（住院号）、床号、送检时间等。
（3）两种标准的送检方法：
①每日一次，连续三天送检，每天制片。
②每日一次，连续三天，每天收集后先预固定（方法见工作规范相关章节），一次性提取细胞成分后离心沉渣涂片或制成细胞蜡块（CB）。
3.送检。原则上留取后立即送检，保持标本新鲜。一般夏天室温存放时间应＜2小时，冬天＜4小时，如确有困难或须做沉渣切片则可以预固定后放置冰箱内冷藏，但不宜＞5天。
4.接收。核对送检单与样本盒（瓶）上的相关信息，一致后签收标本，若信息不一致则需重新与相关人员、科室核对，标本的签收制度必须严格按规定执行。
（二）制片
1.标本取样
（1）大体观察。通常痰液有如下类型，制片操作人员应予以记录。
①水样痰：是指黏液含量少，呈水样，常有泡沫的痰液。
②灰白色黏液痰：黏液丰富，胶样。
③脓性痰：含较多黄脓样黏液的痰液。
④陈旧性血丝痰：在黏液丝中含有较多陈旧性血液的痰液。
⑤坏死样痰：黏液含量少，有较多浑浊蛋黄样物混杂其间。
⑥血痰：痰液血液量多，几乎全为红色。
（2）取样。有选择性地提取痰液有价值部分制片，这在痰液细胞学检查中非常关键，必须注意以下方面：
①用镊子、竹签等无吸水性材料夹取，不主张用玻璃制品、棉签等取样。
②原则上优先选取以下部位：
a.含血丝黏液痰。
b.灰白色豆渣样痰丝（形似白色细线）。
c.透明黏液丝丰富处痰液。
d.血液与黏液交界处痰液。
③黏液丰富的样本与水样痰液样本应注意区别取样的痰液量，一般情况下后者的取样量应多于前者。
2.制片
痰液的制片要注意以下几方面。
（1）普通涂片。
①直接涂片：用镊子或竹签直接涂抹在玻片上，尽量分开黏液丝及血性部分，做到相对均匀，涂片面积应超过玻片空白部位的三分之二。其优点是黏液丝分布明显，病变细胞相对集中，缺点是涂片厚薄不匀、重叠现象多见而影响封片观察，一般一次制片两张以上。
②压拉涂片：将取样的标本置于一张玻片上后，另一张玻片正面朝下压拉下一张玻片，多次推拉、挤压均匀后两边分开得到两张涂片。优点是相对厚薄均匀，但挤压可能导致细胞挤压分散，镜下沿黏液丝查找的线索相对不明显。
（2）液基制片。是指通过标本的预处理后先把痰液的黏液溶解、液化，取到的细胞固定后再通过一定的技术手段把细胞成分转移到玻片上的制片方法。制作过程等同一般的液基制片，但应注意标本预处理中以下方面。
①选取的痰液样本量通常为一张普通制片痰液量的3～5倍。
②在有清洗、固定作用的保存液内存放15min以上。保存液各厂家不尽相同，但主要的成分类似：酒精、甲醛、甲醇等。
③1，4‐二硫苏糖醇（DTT）液消化黏液：用清洗液加10%的DTT粉剂配制成DTT液加入到保存液中1～2ml，震荡10min以上，即可完全溶解保存液中的黏液，使标本完全液体化。
（3）沉渣涂片或细胞蜡块制作。
①需要较大的样本量，通常是用3天的咳痰量混合在一起制作取样，须注意标本的预固定及适当的保存。
②标本需作液化、离心沉淀预处理（同前）。
③沉淀后细胞量少作涂片用（3～5张），涂片方法同浆膜腔积液涂片（见后）；沉淀后细胞丰富者作细胞蜡块，切片备用（制片方法见细针吸取细胞病理学章节）。
④普查、科研等情况下应用较多，因其样本量大，也可进一步应用分子、免疫等新技术。
3.制片的质量控制
（1）样本的选取：直接关系到检查的阳性率，多次检查多张涂片结果的前后一致性应大于80%以上。
（2）涂片应相对均匀，重叠部分面积＜20%，涂片部分面积应大于玻片面积三分之二以上，合格涂片比例应＞80%。
（三）固定
必须采用湿固定，即制片后立即固定，一旦固定不及时，涂片在空气中干燥后，细胞的形态特征将明显受损，所以及时固定非常重要。
1.一般要求制片后立即固定，通常＜5s。
2.固定时间涂片＞15min，细胞蜡块＞30min。
3.固定液为常规固定液，常用85%乙醇溶液。
4.制好的涂片垂直快速放入或自由落体放入固定液，否则会出现细胞堆积而引起皱折现象。
5.必须注意固定液的及时更换。
6.固定槽内多个样本同时放置要杜绝相互间的交叉污染。
（四）染色
痰液脱落细胞病理学检查的常规染色方法是H.E染色和巴氏染色，特殊需要时也可使用抗酸染色等，染色方法见工作规范相关章节。
（五）透明及封片
为保存痰液中细胞结构清晰，涂片染色脱水后必须经二甲苯透明及中性树胶封固。
（六）痰液标本的安全管理与院感控制
痰液样本常常伴随特异性感染，并且需开放性处理，因此实验室的安全管理及院感控制必须引起重视。
1.必须使用密闭性器皿来存放标本。
2.制片操作人员必须戴口罩、帽子、手套等隔离防护措施。
3.有条件的单位对痰液样本在制片前可进行预消毒固定处理，常用预固定液为2%聚乙二醇和50%乙醇混合液。其配制方法为：
（1）10g聚乙二醇（熔点为43～46℃）在50～100℃的温箱中熔化后倒入500ml50%乙醇液中混匀成聚乙二醇溶解液备用（此液不会凝固）。
（2）1L2%聚乙二醇和50%乙醇溶解混合液组成配方为：
水 437ml
85%乙醇液 526ml
聚乙二醇乙醇液 40ml
4.每日一次空气、环境的紫外线消毒，并记录时间，定期检测紫外灯管的紫外线强度。
5.残留样本及盛具统一用1%过氧乙酸液消毒，统一存放专用医疗垃圾袋后处理，处理标本过程中产生的相关污染液体经专用医用污水管道排放。
（七）分子病理学技术在痰液样本中的应用
痰液样本分子病理学检测尽管临床应用较少，但在科研、专项普查等领域仍有一定的应用价值，应用最多的是通过PCR或原位杂交技术检测脱落上皮细胞的以下项目：
（1）端粒及端粒酶检测。
（2）P16基因甲基化检测。
（3）异源核糖核蛋白A2及其异构体。
（4）P53基因。
（5）EGFR相关基因等。
三、痰液涂片的脱落细胞病理学诊断
（一）镜检前的准备及镜检规范：详见工作规范相关章节
（二）镜检内容
1.标本满意度评估
在标本满意的前提下检查的样本其结果才具有可信性，才可保证检查的敏感性与特异性。
（1）满意样本的要求。
①合格的申请单，有详细的临床资料和病史提供，咳痰方法已经过指导，方法正确。
②涂片面积大于玻片面积的三分之二以上，分布均匀，厚薄相对一致，可见黏液丝（普通涂片）。
③镜下见到以下成分表明此样本来自呼吸道：
a.含吞噬颗粒的组织细胞（尘细胞）。
b.柱状上皮细胞（伴或不伴退行性变）。
c.支气管形成的黏液丝（枯丝曼氏螺旋体）。
（2）不满意样本：不能作出诊断意见，建议重新取样并制片。
①申请单内容不全，咳痰时未经专业指导。
②不能确认标本与申请单的一致性。
③涂片面积少于二分之一的阴性标本。
④缺乏满意样本应有的三种成分之一的阴性标本。
⑤固定、染色效果差，细胞严重变形。
以上评估可写入报告单内容中，以将标本满意度信息反馈给临床医师及患者。
2.细胞病理学描述性诊断
目前尚未见有公认的规范性术语作为痰液脱落细胞病理学检查的标准报告方式的报道，建议采用描述性诊断格式。
（1）阴性。阴性是指在合格的痰液涂片样本上未能发现异常线索或非典型细胞。
（2）找到异常线索或非典型细胞。
①找到异常线索：即所谓见痰液涂片的“阳性背景”，但未发现异常细胞，主要是指涂片内发现肿瘤样坏死细胞碎片，黏液丝内发现成崩解红细胞（陈旧性出血）或吞噬红细胞的组织细胞，角化固缩的鳞状上皮细胞残片等，此时应报告异常线索（或肿瘤样坏死背景），建议反复咳痰取样。
②找到非典型细胞，但不能肯定恶性：即以往所谓的“核异质”细胞，细胞形态已有改变，但核大小、染色质颗粒粗细、核浆比、核畸形等多方面尚未达到癌细胞的标准，即所谓“发现异常细胞，不能肯定恶性”，或称“发现可疑癌细胞”，此时应建议反复咳痰送检。
（3）找到癌细胞，但不能肯定其类型。
这类标本指的是痰液涂片内已见确认的癌细胞，但由于各种原因导致分类困难，常见于低‐未分化类型的肺癌样本，对此类标本建议力求区分“小细胞癌”与“非小细胞癌”两类；但确实无特征或诊断无把握时不强求明确亚型。
（4）找到癌细胞，类型考虑为：
①鳞状细胞癌：细胞呈多形性，核畸形性大，染色质粗，块状，核膜不光滑，常见核固缩，胞浆多少不一，副染色质区透亮，奇形怪状核多见，游离及散在癌细胞也较多见。
②腺癌：核粘连成簇，可见三维的乳头状或腺样结构，胞浆多丰富，透明融合状、淡染，核圆或卵圆形，染色质颗粒细，核偏位多见，核仁多明显，坏死多见，游离的细胞量在普通涂片中较少见。
③小细胞癌：约淋巴细胞的2～3倍大小，常见沿黏液丝成“串珠”样分布，胞浆稀少，浓厚的染色质，核仁不明显或缺乏，三角核、镶嵌核等具特征性，易出现核碎裂。
④细支气管肺泡癌：常见合体型组织片，成开花型乳头状片段或指压样片段，细胞小到中等，胞浆尚丰富，核异形性小，粉状或颗粒状染色质，微小到显着的大核仁。
⑤转移性恶性肿瘤：此类肿瘤细胞的痰液检查敏感性不低于原发性肺癌，因此也可作为检测恶性肿瘤是否伴有肺部转移的重要手段。常见有：恶性黑色素瘤、肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌等，在诊断时必须结合临床资料及原发肿瘤的病理形态学表现。
第二节 宫颈／阴道细胞病理学检查
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率居全球女性恶性肿瘤第二位。我国每年有新发病例约13万例，占世界宫颈癌新发病例总数的四分之一，且发病年龄呈年轻化趋势，宫颈癌的预防与治疗任重道远。
宫颈／阴道细胞学是最早应用于临床及普查的细胞病理学检查，其始于希腊医生Papanicolaou（巴氏）对阴道细胞学的研究，巴氏涂片现已被公认为到目前为止最有效的肿瘤普查项目。20世纪末至今，宫颈／阴道细胞病理学检查得到了前所未有的发展，其中最显着的进步莫过于1881年Bethesda系统的正式发表（1888年讨论提出），国内从1884年开始逐渐推广应用；几乎在同期引进的液基薄层细胞技术（Liquid‐based Papsmear，LBP），使得涂片的标准化制作及涂片质量上了一个台阶，两者相互促进，在宫颈／阴道细胞病理学检查上取得了质的飞跃。此外，近几年应用于妇科细胞病理学的新技术、新方法还有HPV相关检查、计算机辅助阅片系统、DNA定量分析等。
一、宫颈／阴道细胞病理学的临床应用
尽管宫颈／阴道细胞学（巴氏涂片）已有近70年的历史，但至今仍是筛选和初步诊断宫颈癌最实用和最有效的方法，现被广泛应用于防癌普查、监测病变发展和临床诊断。
（一）检查目的及应用范围
1.防癌普查及识别癌前病变，有利于癌及其癌前期病变的早期诊断，尤其是发现和诊断CIN1‐3、原位癌及肉眼不能发现的浸润癌。
2.对某些特殊炎症及良性病变具有诊断或辅助诊断作用。宫颈涂片可以显示细菌、真菌及病毒等特异性感染。
3.用于女性激素水平评估，指导内分泌治疗。
4.有助于随诊观察、判断病变有无进展，治疗后有无复发及转移等。
5.实验室检测，如在涂片的基础上应用PCR及原位杂交技术检测HPV的分型等。
（二）宫颈／阴道细胞学检查的病理生理基础
1.子宫颈癌是一种感染性疾病，与HPV感染密切相关，而细胞学检查对HPV感染后的形态学改变有较高的特异性。
2.子宫颈癌的生成是一个缓慢的过程，一般的宫颈癌前病变发展成为宫颈癌需要5～10年的时间，这为在癌前期发现病变提供了充分的时间和多次机会。
3.细胞病理学检查对CIN、原位癌及早期浸润癌具有较高的检出率。
