第1章 丙型肝炎病毒学免疫学特征及分型 (1)

第1章 丙型肝炎病毒学、免疫学特征及分型 (1)

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）发现至今已20年，人们对它的病毒学和免疫学特征的研究不断深入和确切，对它的致病性等认识也逐步深化。可以说，HCV致病性的深入研究、新型药物的开发及疫苗的研制均与其病毒学特征密切相关。因此认识HCV的基因结构和功能、免疫学特征、变异与分型是HCV研究的基础。本章将分三部分介绍HCV的病毒学特征、它感染人体后引起的机体免疫学特征以及它的变异与分型。

一、 丙型肝炎病毒的基因结构和功能

近年来，随着人们对HCV的分子生物学研究不断深入，对其基因组结构以及相关基因表达产物有了进一步的认识。上述研究为HCV的致病机制和抗病毒治疗靶位的选择提供了理论基础。现将HCV的基因组结构和功能分述如下。

1. HCV的基因组结构HCV是单股正链的RNA病毒，属黄病毒科（Flaviviridae）。基因组全长约9.6kb，包含1个大的开放阅读框（ORF）和两侧的5′及3′非编码区（nontranslated region，UTR）。核糖体通过进入HCV 5′UTR端的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）将HCV基因组翻译成1个多聚蛋白前体。该蛋白前体在宿主和病毒蛋白酶的裂解作用下产生至少10个蛋白质，其排列顺序如下：核心蛋白（core，C）、包膜蛋白1（envelope 1，E1）、E2、P7，非结构蛋白2（nonstructural protein 2，NS2），NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。另外，存在1种阅读框替代蛋白（alternative reading frame protein，ARFP），又称F（frame shift）蛋白，是由HCV的C蛋白重叠阅读框翻译获得。它们不但在HCV的生活史中发挥着重要的作用，而且也影响宿主细胞的信号传导、凋亡及物质代谢等一系列生化过程。

HCV基因组的特点之一为它的变异率高，E1和E2区是变异率最高的区域，而5′及3′非编码区则为最保守的区域。它的高变异率使之在人体内呈现准种（quasispecies）分布。

2.非编码区

（1）5′UTR：5′UTR包含HCV基因组5′端的341个核苷酸。它是HCV基因组中最保守的区域。HCV 5′UTR包括4个保守的结构域（structural domain），其中结构域Ⅱ～Ⅳ构成IRES，可直接与40S核糖体亚单位结合，启动HCV前体蛋白的翻译。IRES以帽非依赖方式启动下游HCV编码区基因的翻译，且该活性并不依赖于HCV蛋白的作用，因而HCV的IRES成为抗病毒药物的理想靶位点。结构域Ⅲ是核糖体附着位点最主要的组成部分。此外，5′UTR还含有HCV复制所需的5′顺式复制信号（5′cisreplication signal）。研究显示，5′端125核苷酸序列（结构域Ⅱ～Ⅲ）构成HCV复制所必需的最小5′顺式复制信号，但高效的HCV复制仍需要完整的5′UTR。

（2）3′UTR：3′UTR位于HCV 3′末端，长度200~235个核苷酸，包括1个较短的可变区、1段80个核苷酸的多聚U（poly U）区域及1段高度保守的X尾（98个碱基）。其中，可变区具有基因型的特异性，不同基因型之间具有核苷酸序列的差异。不同基因型的HCV多聚U长度不同。可变区可形成2个茎环结构（VSL1和VSL2），而X尾含3个非常稳定的茎环结构（从5′至3′依次为SL1～3）。

研究显示，完整的3′UTR才能发挥正常作用，不同型别甚至同型别不同株型间3′UTR的互换都会导致HCV RNA无法复制，删除整个poly U、X尾或X尾中任何1个茎环均可彻底阻断HCV RNA复制。然而删除可变区仅影响复制效率，但并不彻底阻断HCV复制，这提示3′末端150个核苷酸序列（包括多聚U/UC区和3′X尾）含有HCV复制所必需的3′顺式复制元件，可能作为启动子来起始负链RNA的合成；其他3′UTR序列对HCV复制起辅助作用。近来的研究提示，3′UTR特别是X尾可通过结合宿主细胞中的多聚嘧啶束结合蛋白（polypyrimidine tractbinding protein，PTB）、自身抗原La（la autoantigen）或一些核糖体蛋白，能增强HCV RNA的稳定性和翻译效率。

3.结构蛋白区

（1）核心蛋白（core protein）：C基因位于HCV基因组342～914核苷酸位点，编码191个氨基酸，蛋白的大小为23kDa，可进一步降解为21kDa，为病毒核衣壳的重要组成部分。与糖蛋白作用组装出完整的HCV病毒颗粒。C蛋白氨基端富含碱性氨基酸且高度保守，其羧基端具有高度的疏水性。C蛋白通过与病毒RNA的结合来调节HCV基因组的翻译，其前1～20个氨基酸可以抑制HCV IRES的翻译。

C蛋白具有基因调控作用，体外的研究显示，C蛋白可通过与宿主蛋白的相互作用调节基因的表达，对原癌基因cmyc、IL2、劳氏肉瘤病毒（RSV）LTR、猿猴空泡病毒SV40早期启动子有激活作用，并且C蛋白可抑制肿瘤抑制基因P53启动子的活性，与HCC的发生相关。C蛋白的另一个重要功能，就是参与HCV感染后的免疫调控。C蛋白通过对LAPC、PAK2、API5、BH1、Tax1BP1、DAXX、TNFAIP3/A20等抗细胞凋亡因子的正调节来抑制细胞的凋亡，增加HCV感染细胞的存活率。而对TNFSF10、CCL20、骨桥蛋白（osteopontin）等的负调节作用抑制了炎症应答以及巨噬细胞吞噬作用，同时C蛋白对Cox2也具有负调节作用。C蛋白对大量基因的调控作用抑制了机体的免疫应答，促进了细胞的持续感染。此外，C蛋白还参与了脂类的代谢，可促进细胞脂质小体的形成，诱导肝脏脂肪变性。

（2）包膜糖蛋白（envelope glycoprotein）：包膜区基因包括E1和E2，分别位于基因组的第915～1490nt位点（E1）和1491～2579nt位点（E2），分别编码192个和363个氨基酸，E1和E2蛋白大小分别为33~35kDa和70~72kDa，包膜糖蛋白构成了病毒的外膜。E1和E2在内质网内，被大量的N2糖基化修饰，并通过非共价键或二硫键形成异源二聚体。E2蛋白羧基端含有疏水锚定区域，作为跨膜结构的一部分具有以下功能：①膜区锚定；②形成E1、E2二聚体；③内质网定位；④包含信号序列。

跨膜结构具有膜活化特性，可以改变细胞膜的通透性。E1～E2复合体在病毒颗粒的装备和释放中的作用还不清楚。在E2的氨基端有2个高变区（HVR），分别是HVR1和HVR2。当HCV患者接受干扰素治疗时，E2的突变增加；在慢性感染过程中，也观察到HVR1序列在不断改变，针对HVR1序列的特异抗体也相应地不断改变；E2含有2个以上中和抗体表位，其中1个位于HVR1。因此表明，E2蛋白是免疫反应的主要目标。此外，E2与病毒受体、tetraspanin、CD81及低密度脂蛋白的受体可发生相互作用，可能在介导病毒附着、进入细胞的过程中起关键作用。因而研究包膜蛋白的抗原变异及宿主免疫应答规律，对HCV疫苗的研究和开发有重要意义。解放军302医院苏海滨等对HCV患者体内的HRV1变异进行研究，发现6个保守的AA位点，串联后免疫小鼠后，诱导出HCV特异性的免疫反应。

（3）F蛋白：HCV C基因除编码C蛋白以外，同时还表达1个16～17kDa的蛋白P16，早期的研究一直认为，这是1个截短的C蛋白。最近的研究证实，这一蛋白是翻译过程中C蛋白编码序列的核糖体阅读框发生-2或+1位漂移所致，并与C蛋白具有相同的N端序列，命名为ARFP或F蛋白。其氨基端10个氨基酸与C完全相同，长短取决于HCV基因型1a亚型编码162个氨基酸，而1b和2a分别编码144和126个氨基酸。F蛋白与内质网相连，并且极不稳定。目前，对它在HCV生活史和复制过程中的作用还知之甚少。仅在HCV感染者血清中可检测到针对F蛋白的特异性抗体，说明在HCV的自然感染过程中，有F蛋白的产生。

抗F蛋白抗体的产生和HCV病毒载量、基因型别以及肝病的分期无关。通过对8份抗F阳性和5份抗F阴性的血清标本的序列分析，未发现任何抗F反应的特殊差异，说明这种抗F反应不受F蛋白的序列异质性的影响。F蛋白可能影响C蛋白的表达，而C蛋白又和免疫调节相关。F蛋白和C蛋白共有的前10个氨基酸序列可能包含RNA和蛋白以及蛋白与蛋白间相互作用区域。F蛋白极短的半衰期以及低表达水平可能与其作为调节蛋白的功能相关。F蛋白的过度表达可阻碍前折叠素2（prefoldin2，PFD2）的正常功能，PFD2是一种帮助蛋白质折叠的辅助蛋白，参与肌动蛋白和微管蛋白的折叠和组装。而细胞支架系统在HCV的感染过程以及细胞功能的调节中起重要作用。因而F蛋白可能会阻碍支架系统中微管蛋白的形成，从而抑制HCV的过度复制，有助于病毒的持续感染。