一、目的要求
1.了解血细胞计数板的构造和用它计数的原理及方法。
2.掌握用显微镜直接测定微生物总数的方法。
二、技能目标
学会微生物数目的直接测定方法。
三、实验原理
血细胞计数板是一块比普通载玻片厚的特制玻片。玻片中有四条凹下的槽构成三个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每个半边上面各刻有一个方格网，方格网上刻有9 个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。
计数室通常有两种规格：一种是大方格内分16中格，每一中格又分为25小格；另一种是一大方格内分为25中格，每一中格分为16小格。但是，不管哪种规格，它们都是由16×25个小方格组成。
计数室的长和宽各1mm，深度为0.1mm，故体积为0.1立方毫米，只要在显微镜下计算出计数室内微生物的细胞数，再按规定方法及公式计算即可得出实际数值。
这种计数方法无论死活细胞都计数在内，为了容易计数，计数前需要对样品作适当稀释。
1.血细胞计数板的正面2.血细胞计数板的侧面3.细胞计数板中央网格放大4.16×25计数板5.25×16计数板四、试剂和器材
1.器材：显微镜、血细胞计数板、滴管、擦镜纸。
2.试剂：啤酒酵母菌悬液、0.1％亚甲蓝染液、生理盐水。
五、操作步骤
1.稀释
取啤酒酵母菌悬液一管（约5mL），加生理盐水适当稀释，以每小格中菌数可数为宜（5～10个）。
2.镜检计数室
在加样前，先对计数板镜检。若有污物，需清洗吹干后进行计数。
3.染色
往啤酒酵母菌悬液中加入0.1％亚甲蓝染液0.5mL，摇匀，使啤酒酵母菌着色。
4.加样
取干净的血细胞计数板盖上盖玻片，用无菌滴管吸取染色的菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让其自行渗入，并充满计数室，注意不可有气泡产生。
5.显微计数
静置5min 后，将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。一般以每小格内有5～10个菌体为宜。计数需要重复两次，若两次数据相差太大，则需要重复计数。
如果使用16（中）×25（小）的计数板，要按对角线方位左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小方格）的细菌数计数。如果使用25（中）×16（小）的计数板，除了取其4个角方位外，还需再数中央的一个中格（即80个小方格）的细菌数计数。
6.计算
16（中）×25（小）计数板：
菌数/mL=100个小方格内菌数/100×400×104×稀释倍数
25（中）×16（小）计数板：
菌数/mL=80个小方格内菌数/80×400×104×稀释倍数
7.清洗
计数完毕，将计数板用清水冲洗干净，洗完后，晾干或用电吹风吹干，镜检，观察是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重洗至干净为止。
六、提醒与技巧
1.若发现菌液太稀或太浓，应重新稀释。
2.计数时，应按一定顺序进行，对于压线的细胞，可按计数上与右，不计下与左的原则，以免重复计数。
3.应适当使用调节器调节焦距，将处于不同深度的细胞全部计算在内。
4.清洗计数板时，切记勿用硬物洗刷。
5.活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应适当关小虹彩光圈并减弱光照的亮度。
附：微生物数目直接测定技术实训报告
实训名称：微生物数目直接测定技术
姓名学号
专业班级
实训地点实训日期
一、实训目的
二、实训原理
三、实训材料
四、实训步骤
五、实训结果及分析
1.记录。
根据实验结果填写下表，并计算每毫升菌液中酵母菌数。
2.计算。
3.结论。
六、问题与思考
血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？如何减少这些误差？
