第七节 致突变试验中的动物实验方法
一、鼠伤寒沙门菌营养缺陷型回复突变试验
鼠伤寒沙门菌营养缺陷型回复突变试验通常简称Ames试验，是目前检测基因突变最常用的方法之一。试验用菌株为鼠伤寒沙门菌不同组氨酸缺陷型突变株，根据致突变物能灵敏而特异地使组氨酸缺陷型突变株回变成原型的特点，在缺乏组氨酸的培养基上，只有少数自发回变菌落生长，而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多，从而判断受使物是否具有致突变性。
Ames试验检测诱变物的方法有平皿掺入法。预培养平皿掺入法及斑点试验法等。平皿掺入法是Ames试验最常用的标准方法。某些致突变物，如二甲基亚硝胺和二乙基亚硝胺等用平皿掺入法难以检出时，可改用预培养平皿掺入法进行试验，此法可使被检物、S9混合液和细菌能在较高浓度下培养，故具有较好的检测敏感性。
（一）试验方法
1.平皿掺入法取融化并保温在45℃的上层培养基一管，每管2ml，依次加入细菌培养液0.1ml，受试物溶液0.1ml，S9混合液或磷酸缓冲液（无需活化时）0.5ml，即在振荡器上混合均匀，倒入底层培养基表面，手握平皿，轻轻旋转，使上层培养基及内含物均匀分布在底层培养基表面。上述混合、倾倒及布匀操作应在20s内完成。平皿在室温下放置几分钟后固化。然后将平皿平放桌面上，并用黑纸遮盖避光，注意平皿的水平放置，避免软琼脂厚度不均，形成表面凸凹不平，影响计数结果的准确性。平皿在室温下放置30～60min 后，将其翻转放入37℃恒温培养箱中。48h后取出平皿，计数每皿的回变菌落数。计算平皿上的菌落时，应观察细菌背景的存在，没有菌苔背景的平皿上出现的菌落不是回变菌落，不应计数。这类菌落是由存活下来的细菌，依靠顶层琼脂内的少量组氨酸供养而形成。当被检物为弱诱变剂或有抑菌作用的诱变剂时，可将培养时间延长至72h观察计数菌落。
2.预培养平皿掺入法本法是在平皿掺入法的基础上，事先将被检物、S9混合液和细菌培养液在水浴中保温一定时间后，然后倒入底层培养基铺平培养即可。具体操作如下：取0.1ml被检物溶液加入无菌试管中，再依次加入0.1ml测试菌株培养液、0.5ml S9混合液或0.5ml磷酸缓冲液，混匀后在37℃水浴中保温20min，或30℃保温30min，以中等速度振荡培养，保温结束后取出试管置冰水浴中。再加入2ml已融化的45℃顶层培养基，振动混匀并迅速倾倒在底层基本培养基上，其余步骤与要求同平皿掺入法。
3.试验剂量受试物最高剂量一般可为5mg/皿。至少有5个剂量组，最低剂量可为0.1～1.0μg/皿。
4.对照
（1）空白对照试验中除基本试验组分外，不外加任何物质，包括作为药物溶解的水和溶剂等。
（2）溶媒对照以被试新药的溶媒作对照，但不引发菌落回变数显著增加。
（3）阳性对照分为间接和直接诱变剂对照，由于使用4种菌株的特性各异，因此使用的诱变剂又会有区别。应特别注意的是，使用间接诱变剂作阳性对照时，应同时设诱变剂不加S9混合物的对照并呈阴性结果，以表明该诱变剂仅在代谢活化条件下才具诱变性，从而也表明S9混合物的有效性。无论直接或间接诱变剂对照中诱发回变菌落数应较自发对照明显增加。
（4）代谢活化（S9）对照是为了排除S9混合物自身对菌落回变可能的影响。
（二）结果的分析与判定
1.回复菌落数受试物所诱发的回复菌落数（x±s）增加，为自发对照的2倍或以上，并有剂量效应关系。
2.测试点某测试点（菌落数）为自发对照的2倍或以上，呈现可重复的并有统计学意义的增加。符合上述一条即可判为阳性。
3.菌株新药的Ames试验推荐使用4种菌株，当其中一株菌呈现肯定阳性变化时即可判定为阳性。试验结果的统计方法以非参数检验较合适。
二、啮齿动物微核试验
啮齿动物微核试验是致突变试验中唯一的一项体内试验，是细胞培养染色体畸变试验的一项补充与验证。
（一）试验准备
1.动物首选NIH小鼠，如无此种小鼠，可改用国内常用的其他品系小鼠。健康性成熟小鼠，体重20～24g。试验全用雄性，每组至少6只，若雌雄兼用，每组10只，雌雄各半。
2.剂量至少3个剂量，最高剂量以1/2LD50为准，尽可能和临床拟用途径一致。
3.对照空白、溶剂和阳性对照组。一般一次给药。
4.骨髓采集时间一般应选择出现微核率阳性变化的最高点作为骨髓采样时间点。若给药后各时间点的微核率无显著变化，则通常在给药后24h处死动物采集骨髓。
（二）试验方法
1.离心法
（1）动物处死用颈椎脱臼法处死小鼠，取一侧股骨，剔除肌肉，用滤纸或纱布擦净附着在股骨上的血污与肌肉，剪去两端股骨头。
（2）取骨髓与离心用1～2ml注射器吸取少量小牛血清，将针尖插入骨髓腔中，推动注射器将骨髓冲入离心管（5ml体积）中，反复冲洗2～3次。用细长滴管吹打骨髓团块，使其呈混悬状态。以速度1000r/min离心7～10min，吸去上层液，用滴管将沉淀物吹打成混悬状。
（3）制片吸取一滴混悬液，滴于洁净载破片一端，以玻片推片将悬液推向载玻片另一端，注意推片的角度与压力，使样本上的细胞适度分散与形态良好。
（4）固定将玻片标本放置甲醇中固定5～15min，取出晾干。亦可将玻片标本平置试验工作台面上，以滴管吸取甲醇液滴在玻片上，待甲醇液在玻片上将要挥发尽时，再补充滴加甲醇液，如此3～5次，晾干。
2.直接法是指将小鼠骨髓直接挤压涂布在玻片上，不必经过离心处理，此法更为简便，是比较常用的方法。操作时，将股骨头剪掉，用小型止血钳夹紧一端，加压将骨髓挤出，涂于事先加有一小滴小牛血清的玻片上，混匀后推片，晾干并经甲醇固定即可。
（三）结果判定
微核的识别通常不太困难，在镜下一般呈圆形或椭圆形，大小不尽相同，小者如针尖，大者可达细胞直径的1/3～1/2.注意鉴别假微核，它们通常可由染料颗粒及血清的污染等造成。必要时用荧光染色加以鉴别。
每只动物的微核玻片标本在油镜下计数1000个多染红细胞（PCE）中的微核数，然后将每组动物的均值以千分率表示。
若给药组试验结果为阴性，则其微核率均值应在正常值范围内；若试验结果为阳性变化，则一般情况下各剂量组之间的变化应呈现剂量-效应关系，即随剂量增高，效应强度也增高，且统计学处理与正常对照有显著性差异，此种结果的阳性判断可以成立；若试验结果仅在某一剂量点出现阳性变化，且可以重复并有统计学意义，亦可判为阳性。
第八节 致癌试验中的动物实验方法
致癌试验是人为地将受使物通过一定的方式与程序给予受试药物，观察在受试动物中肿瘤出现的频率、类型、发生部位与时间等，并与对照物相比阐明受试药物是否有致癌性。在此基础上有条件地推论人类致癌的危险性。致癌试验需要大量实验动物，试验周期长，耗费大，影响因素多。
一、动物实验方法
1.动物选择实验动物的原则是：敏感、经济、自发肿瘤率低、寿命不太长、抗病力强和易于管理等。优先采用的动物为大、小鼠。一般在断奶后开始给药。雌雄各半，动物品系多采用近交系的第一代杂交动物。
2.剂量与给药时间和途径一般设3个剂量组，还应设空白对照组、赋形剂对照组（必要时）。给药时间大鼠为24个月，小鼠为18个月。给药途径原则上应与临床拟用途径一致。
3.动物饲养管理致癌试验持续时间长，因此对试验环境有严格的要求，必须符合国家标准。
4.观察及检查观察受试动物的一般行为状态的变化，包括外表、活动状态和摄食等。定时称量动物体重，注意有无肿瘤发生。对死亡的动物及时进行尸检以查明原因。
病理学检查是致癌试验结果最重要依据。先对动物做外观肉眼检查，以发现有无肉眼可见的肿瘤，然后解剖动物进行内脏器官检查及取样本做病理组织学检查。必要时，可考虑做血液学检查。
二、结果评价
试验结束时，计算受试动物的肿瘤发生率、肿瘤的发生时间、动物的平均寿命等，经统计分析处理做出正确的判断。
第九节 刺激性、过敏性和溶血性试验中的
动物实验方法刺激性、过敏性和溶血性是指受试物制剂经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌内、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性（如刺激性和过敏性等）和（或）对全身产生的毒性（如过敏性和溶血性等）。
一、刺激性试验中的动物实验方法
刺激性是指非口服受试物制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，目的是观察动物的血管、肌肉、皮肤、黏膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。
（一）皮肤刺激性试验
1.实验动物首选兔，也可选用小型猪。每组动物4～8只，雌、雄各半。应设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比法。试验前24h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。去毛范围左、右各3cm×3cm，在用药部位用砂纸磨或划“#”字并以渗血为度。
2.给药方法取受试物0.5ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用2层纱布（2.5cm×2.5cm）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋形剂作对照。贴敷时间至少4h。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4周。
3.结果观察在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。
（1）单次给药皮肤刺激性试验去除药物后30～60min，24、48和72h，肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14天。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。
（2）多次给药皮肤刺激性试验在每次去除药物后1h以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间。末次贴敷后，在去除药物后30～60min，24、48和72h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。其他同单次刺激试验。
4.结果评价
（1）单次给药皮肤刺激性试验计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分均值，进行刺激强度评价。
（2）多次给药皮肤刺激性试验计算每一观察时间点各组积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物积分均值，进行刺激强度评价。
（二）注射给药部位刺激性试验
1.实验动物首选兔，每组动物数不少于3只。应设生理盐水对照，可采用同体左右侧自身对比法。用药部位根据药物的给药途径确定，可选用耳缘静脉、耳中心动脉（其他动物可选用前、后肢静脉及股动脉等）、股和背部肌肉、侧胸壁皮下组织、静脉旁组织等。
2.给药方法应根据受试物的特点采用最可能暴露毒性的给药方法。一般按临床给药方案给予受试物，给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据受试物拟用于临床应用的情况来决定，多次给药一般不超过7天。
3.结果观察根据受试物的特点和刺激性反应情况来选择适当的观察时间。通常单次给药刺激性试验，在给药后48～96h对动物和注射部位进行肉眼观察；多次给药刺激性试验，每天给药前以及最后一次给药后48～96h对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查。留下的动物根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14～21天再进行组织病理学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。
4.结果评价根据肉眼观察和组织病理学检查的结果进行综合判断。
（三）眼刺激性试验
1.实验动物首选家兔，每组动物数不少于3只。应设置生理盐水对照组，可采用同体左右侧自身对比法。试验前24h内对每只动物的双眼进行检查（包括使用荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。
2.给药方法每只眼睛滴入0.05～0.1ml或涂敷0.1g受试物，然后轻合眼睑约10s。一般不需冲洗眼睛。给药期限应根据受试物拟用于临床的情况来决定，多次给药时每天给受试物的次数应与临床用药频率相同，连续给受试物2～4周，一般不超过4周。
3.结果观察应根据受试物的特点和刺激性反应情况来选择适当的观察时间。通常单次给药眼刺激试验，在给药后1、2、4、24、48和72h对眼部进行检查，也可根据受试物的特点适当调整观察时间；多次给药眼刺激试验，每天给药前以及最后一次给药后1、2、4、24、48和72h对眼部进行检查，也可根据受试物的特点适当调整观察时间。如果在72h未见任何刺激症状，试验则可结束。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限，但一般不超过21天。
4.结果评价将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。根据分值判断其刺激程度。
（四）皮肤光毒性试验
光毒性反应是指药物吸收的紫外光能量在皮肤中释放导致皮肤损伤的作用，即皮肤或全身接触或应用化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引起的一种皮肤毒性反应。它是光敏反应中最常见的一种反应，具有剂量依赖性，其临床表现与晒伤相似，表现为红斑、水肿、皮肤瘙痒和色素沉着，严重者可产生局部坏死、溃烂或表皮脱落。
1.实验动物成年白色豚鼠，雌雄各半。
2.试验分组设阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组应给予赋形剂或溶媒，阳性对照组给予8-甲氧基补骨脂素，受试物低剂量组给予临床用药浓度，高剂量组给予不引起皮肤刺激反应的浓度。正式试验的每组动物数至少6只。
3.UV光源
（1）UV光源波长为320～400nm的UVA，如含有UVB，其剂量不得超过0.1J/cm2.
（2）强度的测定用前需用辐射计量仪在试验动物背部照射区设6个点测定光强度（mW/cm2），以平均值计。
（3）照射时间的计算照射剂量为10J/cm2，按下式计算照射时间。
照射时间（秒）=照射剂量（10000mJ/cm2）/光强度\[mJ/cm2·sec\]
4.试验步骤
（1）进行正式光毒试验前18～24h，将动物脊柱两侧皮肤去毛，试验部位皮肤需完好，无损伤及异常。备4块去毛区，每块去毛面积约为2cm×2cm。
（2）将动物固定，在动物去毛区1和2涂敷0.2ml（g）受试物或阳性对照药，3和4涂敷同体积（量）的赋形剂或溶媒。给药30min后，左侧用铝箔覆盖，胶带固定，右侧用UVA进行照射。
（3）结束后分别于1、24、48和72h观察皮肤反应，给每只动物评分。
5.结果评价单纯涂受试物而未经照射区域未出现皮肤反应，而涂受试物后经照射的区域出现皮肤反应分值之和为2或2以上的动物数为1只或1只以上时，判为受试物具有光毒性。
二、过敏性试验中的动物实验方法
过敏性指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理性免疫反应。过敏性试验是观察动物接触受试物后是否产生全身或局部过敏反应。
（一）被动皮肤过敏试验（PCA）
1.实验动物PCA反应常用的动物是大鼠和小鼠，亦可选用豚鼠，选择动物时应考虑IgE的出现时间。
2.试验分组设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组给予同体积的溶媒，阳性对照组给予1～5mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质，受试物低剂量组给予临床最大剂量，受试物高剂量组给予低剂量的数倍量。每组动物数至少6只。
3.致敏
（1）抗体的制备选择容易产生抗体的给药方法，如静脉、腹腔或皮下注射等，隔日1次，共3～5次。末次致敏后10～14天左右采血，2000r/min离心10min，分离血清，-20℃保存，2周内备用。
（2）被动致敏上述各组抗血清应根据反应特点决定稀释倍数，一般用生理盐水稀释成1：2、1：4、1：8、1：16或1：32等。在动物背部预先脱毛3cm×4cm的皮内注射各对应组的抗血清0.1ml，进行被动致敏。
（3）激发被动致敏24h或48h后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.5%～1%伊文思兰染料共1ml，进行激发。需注意激发时间选择的合理性。
4.结果测定30min后麻醉处死各组动物，剪取背部皮肤，测量皮肤内层的斑点大小，直径大于5mm者判定为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和的一半。
（二）全身主动过敏试验（ASA）
1.实验动物选用体重为300～400g的豚鼠。
2.试验分组同PCA。
3.致敏选择容易产生抗体的给药方法，如静脉、腹腔或皮下注射等，隔日一次，共3～5次。
4.激发
（1）激发途径一次快速静脉内给药。
（2）激发次数末次注射后第10～14天一次激发。
（3）激发剂量一般为致敏剂量的2～5倍量，给药容积1～2ml。
5.观察指标
（1）致敏期间每日观察每只动物的症状。初次，最后一次致敏和激发当日测定每组每只动物的体重。
（2）激发静脉注射后至30min，详细观察每只动物的反应症状，症状的出现及消失时间。最长观察3h。注：激发注射后，若发现有过敏反应症状时，取健康未致敏豚鼠2只，静脉注射激发剂量的受试物，观察有无受试物作用引起的类似过敏反应症状，以供结果判断时参考。
6.结果评价判断过敏反应发生程度和计算过敏反应发生率。对结果进行综合判断。
（三）豚鼠最大化试验（GPMT）和Buehler试验（BT）
实验动物皮内或涂皮给予诱导剂量的受试物，经过10～14天的诱导期，然后给予激发剂量的受试物，以观察是否出现了过敏反应。
1.实验动物成年豚鼠，雌雄不拘。受试物组不少于20只、对照组不少于10只。
2.对照设立阴性对照组和阳性对照组。阳性对照物有巯基苯并噻唑，苯佐卡因，二硝基氯苯，331环氧树脂等，也可以使用其他的阳性对照物，但轻至中度的致敏剂在加佐剂的试验中至少30%和不加佐剂试验中至少15%应有反应。
3.剂量Buehler试验中致敏剂量应当足够高，以产生轻微的刺激性，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。GPMT试验中致敏剂量应足够高，以产生轻至中度的皮肤刺激性且能很好地全身耐受，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。
4.试验步骤
（1）Buehler试验在第0、6～8和13～15天用封闭片局部给药以诱导，在第27～28天在未给药的肋腹部贴6h以局部激发。去除封闭片24和48h后读取结果。如果结果难以判定，1周后再次激发，可采用原来的对照组或新的对照组。
（2）GMPT试验采用皮内注射给药，加和不加佐剂进行诱导，5～8天后再次局部诱导，第20～22天给予激发剂量24h，在去除激发剂量24和48h后读取结果。如果结果难以判定，1周后再次激发。
5.观察指标
（1）一般在致敏后1h和24h及激发后24h和48h观察皮肤红斑、水肿和其他异常反应，对红斑和水肿进行评分，根据毒性反应情况适当调整观察时间。
（2）测定开始和结束时的动物体重。
6.结果评价判断过敏反应发生程度，计算过敏反应发生率。
（四）皮肤光过敏性试验
光过敏性系药物吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中的蛋白结合成为药物-蛋白质结合物（全抗原），经表皮的朗格汉斯细胞传递给免疫活性细胞，引起过敏反应的作用。
1.实验动物使用健康白色豚鼠，每组不少于5只。
2.试验分组应设阳性对照药组、阴性对照组和受试物组。
3.试验方法
（1）Adjuvant and Strip法先皮内注射FCA，用透明胶带擦伤皮肤角质层，涂敷受试物，照射紫外线，以上操作反复5次进行致敏，2周后再次涂敷受试物，照射紫外线激发。
（2）Harber法涂敷受试物，照射紫外线，此操作隔日进行1次共3次致敏。3周后再次涂敷受试物的稀释液，30min后照射紫外线激发。
（3）Horio法涂敷20%的月桂醇硫酸钠，再涂敷受试物，立即照射紫外线，此操作每日一次，共3次致敏。14天后再次涂敷受试物，照射紫外线激发。
（4）Jordan法用尼龙刷子损伤皮肤后，涂敷受试物，1h后照射紫外线，此操作每周5次，连续3周进行致敏，2周后再涂敷受试物，6h后照射紫外线，此操作连续2日进行激发。
（5）Maurer法涂敷受试物，1h后照射紫外线及可见光线进行致敏。6周和9周后，各3天连续涂敷受试物，30min后照射紫外线进行激发。
（6）Morikawa法涂敷受试物，30min后照射紫外线，本操作每周连续5天，共2周进行致敏，致敏2周后，涂敷受试物，30min后照射紫外线进行激发。
（7）Vinson法涂敷受试物，照射紫外线，本操作每日1次，连续5次进行致敏，7～10天后，再次涂敷受试物，照射紫外线进行激发。
4.结果评价遵守各试验方法所记载的判定标准，比较对照组和给药组的反应对受试物的皮肤光敏性反应进行评价。阳性结果时，应追加试验，必要时，应追加光毒性试验。
三、溶血性试验中的动物实验方法
溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应。溶血性反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应；非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。溶血性试验是观察受试物是否能够引起溶血和红细胞凝聚等反应。
（一）常规的体外试管法（肉眼观察法）
1.血细胞悬液的配制取兔血（或羊血）数毫升，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10min，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1000～1500r/min离心15min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2%的混悬液，供试验用。
2.受试物的制备除另有规定外，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用0.9%氯化钠溶液1：3稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。
3.试验方法取洁净试管7只，进行编号，1～5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。
4.结果观察若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
（二）结果判断
当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3h内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3h内发生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射用。
第十节 依赖性试验中的动物实验方法
药物依赖性试验包括身体依赖性和精神依赖性试验。
一、身体依赖性试验
评价镇痛药和镇静催眠药时常须进行以下几方面的依赖性试验。
（一）自然戒断试验
自然戒断试验是连续给予动物一段时间的受试药后突然停药，观察动物出现的戒断症状，与同类的药物比较，判断受试药物的依赖性潜力。
1.实验动物必须用小鼠、大鼠和猴3种动物进行试验。小鼠的初始体重为20～24g，每组至少20只；大鼠的初始体重为180～220g，每组至少10只；猴的体重为3～5kg，每组3～5只；以上动物均雌雄各半。
2.剂量及分组至少2～3剂量组，并设赋性剂对照组和阳性药对照组（镇痛药选择吗啡，镇静催眠药选择苯巴比妥或巴比妥）。低剂量一般采用临床用药剂量，高剂量选择接近毒性反应的剂量，中剂量介于高、低剂量之间。
3.给药途径1～2种给药途径，至少有一种为临床用药途径。
4.给药期限镇痛药在小鼠、大鼠给药30天，猴90天；镇静催眠药在小鼠、大鼠给药60～90天，猴180天。每天给药2次，上下午各1次。
5.观察指标镇痛药在停药前24h及停药后48h内，每隔4h观察记录动物的外观体征和行为活动、自主神经系统功能变化，并称体重。镇静催眠药在停药前一天及停药后1～2周内每天观察动物的外观体征和行为活动及自发惊厥发生率。
（1）外观体征和行为活动包括应激性、神情过敏（猴）、饮食、睡眠、自发运动活动、攻击性、警觉程度、神经反射、竖尾、震颤、惊厥、呼吸、体温、体重。
（2）自主神经系统功能变化包括腹泻、流涎、流泪、恶心、呕吐、瞳孔大小。
6.结果统计戒断症状用记分法统计，对检测指标和体重、惊厥发生率等应设计合理的分值，试验结果进行统计学处理。
（二）替代试验
替代试验是给予动物各类代表药（如吗啡、苯巴比妥或巴比妥）等使之产生身体依赖性后，停止给予代表药，给予受试药以替代之，观察记录动物是否有戒断症状及其发作程度，从而判断受试药物的依赖性潜力。
1.实验动物须用小鼠、大鼠和猴3种动物进行试验。小鼠的初始体重为20～24g，每组至少20只；大鼠的初始体重为180～220g，每组至少10只；猴的体重为3～5kg，每组3～5只；以上动物均雌雄各半。
2.剂量及分组至少2～3剂量组，并设赋性剂对照组和阳性药对照组（镇痛药选择吗啡，镇静催眠药选择苯巴比妥或巴比妥）。低剂量一般采用临床用药剂量，高剂量选择接近毒性反应的剂量，中剂量介于高、低剂量之间。
3.给药途径1～2种给药途径，至少有一种为临床用药途径。可选择腹腔注射、灌胃或“药掺食”法给予动物代表药物使之产生身体依赖性，然后停止给代表药，以同样给药方式给予不同剂量的受试药（在用“药掺食”法形成对代表药的身体依赖性试验中，受试药可用腹腔注射或灌胃的给药方式进行替代）。
观察记录替代期间动物的戒断行为和体重变化，镇痛药的观察期为停止吗啡前24h和停药后48h内，每隔4h观察1次；镇静催眠药的观察期为停止代表药前1天和停药后的1～2周内，每天观察1次。
观察指标和结果统计参照“自然戒断试验”。
（三）催促试验
催促试验是在短时期内给予动物大剂量受试药，然后注射一剂受体拮抗剂，观察和记录是否出现戒断症状及其程度。此法只适用于有竞争性受体拮抗剂的阿片类药物。
1.实验动物参照“自然戒断试验”。
2.剂量除低剂量一般采用临床剂量的1～2倍外，余同“自然戒断试验”。
3.给药途径猴的试验应与临床给药途径相同；大、小鼠的试验选用2种给药途径，其中须有一种与临床给药途径相同。
4.给药期限猴连续给药30～60天，上下午各1次，大、小鼠连续给药3～5天。停药后给予一剂阿片类受体拮抗剂，常用纳洛酮及环丙羟丙吗啡。观察给予受体拮抗剂后1～2h内动物出现的戒断症状及体重变化。
5.观察指标参照“自然戒断试验”。小鼠还应记录跳跃次数。
6.结果统计参照“自然戒断试验”。
（四）诱导试验
大部分镇静催眠药无竞争性受体拮抗剂，不能进行催促试验，可采用诱导试验。判断镇静催眠药的一项重要指标是惊厥。在自然诱发试验中，动物需进行较长时间给药才有可能在停药后出现自发性惊厥，而诱导试验可以应用各种诱发惊厥的方法，如听源性发作、戊四唑惊厥。试验中采用阈下刺激强度，它们对正常动物不引起惊厥发作，但在对镇静催眠药产生依赖性的动物中，在停药期间出现反跳性兴奋，原来的阈下刺激就可能诱发惊厥。
1.实验动物大鼠、小鼠。应预先挑选合格鼠，即对各种阈下刺激无惊厥性反应。听源性发作法较常用。
2.剂量参照“自然戒断试验”，阳性代表药为苯巴比妥或巴比妥。
3.给药途径2种给药途径，必须有一种为临床用药途径。
4.给药期限30天，每天2次，上下午各1次。
5.观察指标听源性发作试验在停药后的1周内每天记录发作率和体重；戊四唑试验在停药24h后记录1次发作率和体重。
6.结果统计参照“自然戒断试验”。
二、精神依赖性试验
评价新药的精神依赖性潜力，可采用“自身给药”试验。这是一种操作式条件行为试验，是当前国际上通用的评价药物精神依赖性潜力的试验方法。
1.实验动物大鼠，体重200～300g，雌雄各半。
2.剂量及分组1～2剂量组，加上1个阳性对照组（阿片类代表药为盐酸吗啡，镇静催眠药代表为苯巴比妥或戊巴比妥钠），每组10只动物。
3.试验方法用戊巴比妥钠麻醉动物，行颈外静脉插管术，将插管一端固定于血管内，另一端经皮下从大鼠背部穿出，接于自由转轴装置上，与恒速泵及药液输入系统相连。手术后的大鼠放入特制的自身给药试验笼中单笼饲养。术后第2天开始对大鼠进行自身给药训练，直至动物建立自身给药（踏板）行为。
4.观察指标形成自身给药行为的潜伏期、每个试验期内大鼠的自身给药次数、行为变化、自身给药行为随药物浓度变动的变化程度、消退反应、与其他药物的相互替代等。
5.结果统计参照“自然戒断试验”。
