一、目的要求
1.了解消毒和灭菌的原理。
2.掌握各种灭菌方法的操作步骤。
二、技能目标
1.能正确使用高压灭菌锅。
2.能够用干燥箱进行器皿及用具的灭菌。
三、试剂和器材
1.仪器或其他用具：包扎的培养皿、试管、移液管等，电热鼓风干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，镊子，玻璃涂棒。
2.培养基：配制好的培养基及生理盐水。
四、基本原理
在微生物实验中，必须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在121.3℃灭菌20min 即可。
干热灭菌同样是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160℃～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。
五、操作步骤
（一）干热灭菌法
干热灭菌使用的是电热干燥箱（干燥箱）。
1.装入待灭菌物品：将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内，关好箱门。堆积时要留有空隙，物品不要摆放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板、温度探头，以防包装纸烤焦起火。
2.升温：接通电源，打开开关，适当打开电热干燥箱顶部的排气孔，旋动恒温调节器，使温度逐步上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示电热干燥箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160℃～170℃，则需要转动温度调节器使红灯亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。
3.恒温：当温度升到160℃～170℃时，借助恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。干热灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。
4.降温：切断电源，自然降温。
5.开箱取物：待电热干燥箱内温度降到60℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。同时，应将温度调节旋钮调到零点，并打开排气孔。电热干燥箱内温度未降到60℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
（二）高压蒸汽灭菌
实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其结构和工作原理是相同的。本实验介绍的是非自控手提式高压蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考厂家说明书。具体操作步骤如下。
1.加水
首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。
2.装料
放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。
3.加盖
将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。
4.排气
打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5min。
5.升压
冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。
6.保压
当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。如本实验中采用0.1MPa，121.5℃，20min 灭菌。
7.降压
达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。
8.无菌检查
将已灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱培养24h，检查无杂菌生长后，即可使用。
附：消毒灭菌技术实训报告
实训名称：消毒灭菌技术
姓名学号
专业班级
实训地点实训日期
一、实训目的
二、实训原理
三、实训材料
四、实训步骤
五、实训结果及分析
1.记录A不同物品所用灭菌的方法及灭菌条件。
2.简要说明高压蒸汽灭菌器的操作过程及操作关键。
六、问题与思考
1.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？
2.干热灭菌应该注意哪些事项？
3.高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？
4.高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？
