第11章 核酸化学(1)

（第一节 ）概述

核酸是生物体内一类重要的生物大分子，是生命活动的重要物质基础。现已证明，任何生物，从病毒、细菌等低等生物，到植物、动物等高等生物体内都含有核酸，核酸占细胞干重的5％～15％。核酸研究经历了100多年的漫长岁月，目前仍是生命化学研究中的一个非常重要的领域。

核酸是瑞士一位年轻科学家Miescher于1868年首先发现的，当时他从外科绷带的脓细胞中分离出细胞核，再从细胞核中分离得到了一种含磷很多的酸性化合物，称为核素。1889年Ahman制备了不含蛋白质的核酸制品，命名为核酸。

核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。前者是遗传信息的贮存和携带者，是遗传的物质基础；后者主要参与遗传信息的传递和表达，在蛋白质生物合成过程中起重要作用。核酸对生物体的生长、繁殖、遗传、代谢等都有极其重要作用。

核酸普遍存在于生物界，常与蛋白质结合存在。除病毒外所有的生物细胞都同时含有两类核酸，而病毒只含其中之一，或含DNA，或含RNA。DNA主要分布在细胞核，少量分布在线粒体和叶绿体等细胞器中；RNA主要分布在细胞质中，少量分布在细胞核。RNA中又分mRNA（信使RNA）、tRNA（转运RNA）和rRNA（核糖体RNA）3种。

一、染色体、DNA、基因

染色体是细胞核内能够被碱性染料染色的物质（染色质）的聚缩棒状结构，主要是由DNA和蛋白质组成的复合物。染色体是遗传信息的载体。

DNA是脱氧核糖核酸，是由数量庞大的4种脱氧核苷酸连接而成的多聚核苷酸大分子，生物体的遗传特征是由DNA中特定的核苷酸序列决定的。

基因是指DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是DNA分子中最小的功能单位，基因包含于DNA大分子中，存在于染色体上，基因在遗传中具有独立性和完整性。

二、核酸的化学组成

1.核酸的元素组成

核酸主要有C、H、O、N、P等元素组成，其中P含量比较恒定，一般为9％～10％，平均0．091，即1g磷相当于11g核酸，故可作为核酸定量的依据。核酸定量测定的经典方法中，多以磷含量来代表核酸含量。

2.核酸的分子组成

核酸莲续水解的降解产物

核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用色谱或电泳等方法分离鉴定。核酸的逐步水解过程可总结如图5-1。

核糖的结构

（1）核糖和脱氧核糖DNA和RNA两类核酸所含戊糖不同，DNA所含的戊糖为D-2-

脱氧核糖，RNA所含戊糖为D-核糖，其结构式如图5-2。

为了区别碱基上的碳原子编号，核糖上的碳原子编号的上方都加上“‘”，如1"、3"等表示核糖上的第一和第三位碳原子。

碱基的结构

（2）嘌呤碱和嘧啶碱嘌呤碱为核酸中的嘌呤物质，主要为腺嘌呤和鸟嘌呤，次黄嘌呤是腺嘌呤的代谢产物，结构式如图5-3。

核酸中存在的嘧啶碱主要有胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，它们的结构式如图5-4。

嘧啶的结构

DNA分子中的碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，RNA分子中的碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，两类核酸所含的嘌呤碱基相同，不同的是在RNA中以尿嘧啶代替了DNA中的胸腺嘧啶。

碱基通常取其英文名称前3个字母表示，如腺瞟呤（adenine）为Ade，鸟嘌呤（guanine）

为（Gua，胞嘧啶（cytosine）为Cyt，尿嘧啶（uracil）为Ura，胸腺嘧啶（thymine）为Thy；还可直接取第一个字母表示，分别为A、G、C、U、T，近些年单字符号使用更多。

在一些核酸中还存在有少量其他修饰碱基，由于这些修饰碱基通常含量很少，所以也叫做微量碱基或稀有碱基。核酸中的修饰碱基多是四种主要碱基的衍生物，其结构多种多样。

tRNA中的修饰碱基种类较多，如次黄嘌呤、二氢尿嘧啶等。

（3）磷酸两类核酸中都含有无机磷酸，所以呈酸性。

3.核酸的基本单位——核苷酸

（1）核苷核苷是核糖（或脱氧核糖）与嘌呤碱（或嘧啶碱）生成的糖苷，糖环上的C1与嘌呤碱N9（或嘧啶碱的N1）相连接，形成糖苷键。

核苷用单字符号A、G、C、U表示，脱氧核苷则在单字符号前加一小写的d，表示为dA、dG、dC、dT，见表5-5。

核苷的类别

核糖核苷代号脱氧核糖核苷代号

腺苷A脱氧腺苷dA

鸟苷G脱氧鸟苷dG

胞苷C脱氧胞苷dC

尿苷U脱氧胸苷dT

（2）核苷酸核苷酸是核苷的磷酸酯。核苷酸的核糖有3个自由的羟基，可以磷酸酯化而分别生成2"-核苷酸、3"-核苷酸和5"-核苷酸。脱氧核苷酸的糖上只有2个自由羟基，只能生成3"-脱氧核苷酸和5"-脱氧核苷酸。生物体内游离核苷酸多为5"-核苷酸。所以通常将核苷5"-磷酸称为核苷磷酸或核苷酸。各种核苷酸在文献中通常用英文缩写表示，见表5-6。

核苷酸的类别

核苷酸代号脱氧核苷酸代号

腺苷（一磷）酸AMF脱氧腺苷酸dAMP

鸟苷（一磷）酸GMP脱氧鸟苷酸dGMP

胞苷（一磷）酸CMP脱氧胞苷酸dGMP

尿苷（一磷）酸UMP脱氧胸苷酸dTMP

生物体内的核苷一磷酸可以与一分子磷酸结合，从而形成核苷二磷酸；核苷二磷酸再与一分子磷酸结合形成核苷三磷酸；如生物体内的AMP可与一分子磷酸结合成腺苷二磷酸（ADP），ADP再与一分子磷酸结合成腺苷三磷酸（ATP）（图5—7）。其他单核苷酸也可以和腺苷酸一样磷酸化，产生相应的二磷酸化合物。各种核苷三磷酸（ATP，CTP，GTP，UTP）是体内RNA合成的直接原料，各脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）

腺苷酸及其磷酸化

是DNA合成的直接原料。核苷三磷酸化合物在生物体的能量代谢中起着重要的作用。其中ATP在所有生物系统化学能的贮藏和利用中起着关键的作用。有些核苷三磷酸还参与特定的代谢过程，如UTP参加糖的互相转化与合成、CTP参加磷脂的合成、GTP参加蛋白质和嘌呤的合成等。

核苷酸的连接方式

（3）核苷酸的连接方式组成核酸大分子的基本单位是核苷酸，很多实验证明DNA和RNA都是没有分支的多核苷酸长链。链中每个核苷酸的3"-羟基和相邻核苷酸的戊糖上的5"-磷酸相连。因此，核苷酸间的连接键是3"，5"-磷酸二酯键，由相间排列的戊糖和磷酸构成核酸大分子的主链（图5—8中框内部分），而代表其特性的碱基则可以看成是有次序地连接在其主链上的侧链基团。

（第二节 ）核酸的性质及研究技术

核酸的性质是由其组成成分和结构决定的，核酸的研究和分离制备则应根据核酸的性质和结构特点等进行。核酸的主要组分是碱基、戊糖和磷酸。核酸的结构特点是相对分子质量大，分子中具有共轭双键、氢键、糖苷键和3"，5"-磷酸二酷键，还有许多活性基团，如羟基、磷酸基、氨基等，这些组分及结构特点，决定了核酸的性质，并作为设计研究核酸技术的依据。

核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基），也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质，可以利用电泳进行分离和研究其特性。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基是弱碱，所以核酸表现为酸性，其等电点比较低，如DNA的等电点为4～4．5，RNA的等电点为2～2．5。

一、核酸的溶解性

RNA和DNA及其组成成分核苷酸、核苷、碱基的纯品都是白色粉末或结晶，而大分子DNA则为疏松的石棉一样的纤维状结晶。

1.溶解性碱基、核苷酸和核酸具有不同的溶解性DNA和RNA都是极性化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿、三氯乙酸等有机溶剂。所以在分离核酸时，采用加入2倍体积的乙醇使核酸沉淀的方法对其进行纯化。核酸、核苷酸、碱基在水中的溶解度依次减小，但核酸的钠盐比自由酸易溶于水；不同核酸在水中溶解所需盐浓度不同。

大多数DNA为线形分子，分子极不对称，其长度可以达到几厘米，而分子的直径只有2nm。DNA溶液的黏度极高，RNA溶液的黏度要小得多。

2.0．14摩尔法——DNA蛋白和RNA蛋白的分离方法不同在生物体细胞内，大多数核酸（DNA和RNA）都与蛋白质结合成核蛋白形式存在，即DNA蛋白（DNP）和RNA蛋白（RNP）。两种核酸蛋白在水中的溶解度受盐浓度的影响不相同。DNA蛋白的溶解度在低浓度盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol／L NaCl溶液中的溶解度要比纯水中高2倍，可是在0．14mol／L的NaCl溶液中溶解度最低（几乎不溶）。

RNA蛋白在溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0．14mol／L NaCl溶液中溶解度却较大。因此，在核酸分离提取时，常用0．14mol／L NaCl溶液条件来分别提取DNA蛋白和RNA蛋白，然后用蛋白质变性剂（如十二烷基硫酸钠）去除蛋白，即得纯的DNA或RNA。此法称为0．14摩尔法。

二、核酸的解离

核酸可被酸、碱或酶水解成为各种组分，通常使用色谱、电泳方法分离，其水解程度随水解条件而异。RNA能在室温下被稀碱水解成核苷酸，而DNA对碱稳定，常利用此性质测定RNA的碱基组成或除去溶液中的RNA杂质。

三、核酸的紫外吸收

核酸中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系存在，碱基、核苷、核苷酸、核酸都在240～290nm范围内有强烈的紫外吸收特征。由于各组分结构上的差异，其紫外吸收也有区别。例如，最大吸收波长AMP为257nm、GMP为256nm、CMP为280 nm、UMP为262nm。通常在对核酸及核苷酸测定时，选用260nm波长。由于蛋白质在这一光区仅有微弱的吸收，因此可以利用核酸的这一光学特性来定位它在细胞和组织中的分布，细胞的紫外线照相主要是利用核酸强烈吸收紫外线的特性。

利用紫外吸收作核苷酸的定性测定时，通常以下列几个数据判断：最大吸收波长（λmax）、最小吸收波长（λmin）、在两个波长下吸收比值：250nm／260nm、280nm／260nrn和290nm／260nm。

作定量测定时，可用下式求出核苷酸含量：

核苷酸含量（％）=Mr×A260×100％／ε260×c式中，Mr为核苷酸相对分子质量；ε260为在260nm的消光系数；c为样品质量浓度，mg／mL；A260为样品在260nm波长下的吸收值。

对于大分子核酸的测定，常用比消光系数法或摩尔磷原子消光系数法。比消光系数ε是指一定质量浓度（mg／mL或μg／mL）的核酸溶液在260nm的吸收值，是非常有用的数据，如天然状态的DNA的比消光系数为0．020，是指浓度为1μg／mL的天然DNA水溶液在260nm的吸收值。也就是说，当测得A260=1时，就相当于样品中含DNA 50μg／mL。RNA的比消光系数为0．025。

摩尔磷原子消光系数ε（P）是指含磷为1mol／L浓度时的核酸水溶液在260nm处的吸收值。在pH=7．0条件下，天然DNA的ε（P）值为6000～8000，RNA为7000～10000。当核酸变性或降解时，ε（P）值大大升高。因为大分子核酸的相对分子质量难以确定，所以用摩尔磷原子消光法测定大分子核酸更为方便。

四、核酸的变性与复性

1.核酸的变性

（1）变性的概念核酸变性指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程。变性只涉及次级键的变化，磷酸二酯键的断裂称为核酸降解。变性后的核酸，其理化性质和生物功能都会起急剧变化，最重要的表现为黏度降低，沉降速度增高，紫外线吸收急剧增高。RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA明显。

（2）变性因素引起变性的外部因素有加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、甲酰胺等，它们都能破坏氢键、盐键、疏水键、碱基堆积力等次级键，从而破坏双螺旋区。

DNA变性的特点是爆发式的，类似于结晶的溶解，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。引起DNA发生“熔解”的温度变化范围不过几度，这个温度范围的中点称为解链温度，用Tm表示，DNA的Tm值一般在70℃～85℃之间。

（3）影响Tm的因素

①G-C对含量G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，Tm值也愈高。

经验公式为：

（G＋C）％=（Tm-69．3）×2．44

③溶液的离子强度离子强度较低的介质中，Tm较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用较低的离子强度。

③溶液的pH值高pH值下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力；pH>11．3

时，DNA完全变性；pH<5．0时，DNA易脱嘌呤。对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性状态。

④变性剂甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂。

2.核酸的复性

（1）复性的概念DNA的变性是可逆的，解除变性条件后，变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称复性。对已经热变性的DNA溶液缓慢冷却，双螺旋DNA又重新形成，故复性又称退火。

复性时单链随机碰撞，不能形成碱基配对或只形成局部碱基配对时，在较高的温度下两链重又分离，经多次试探性碰撞才能形成正确的互补区。所以，核酸复性时，温度不宜过低，（Tm-25）℃是较合适的复性温度。

（2）影响复性速度的因素

①单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。

②较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。

③片段内的重复序列多，则容易形成互补区，因而复性较快。

维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。

五、核酸的含量与纯度测定

核酸含量的测定方法有紫外吸收法、定磷法、定糖法、凝胶电泳法。紫外吸收法方便，样品便于回收，是常用的方法，但灵敏度不高。凝胶电泳法配合分析扫描仪能够精确测出核酸含量。定糖法和定磷法则是通过化学方法测定核糖或磷酸，从而测定核酸的含量。

1.定磷、定糖——测定核酸含量