2.液氮保存法将培养18-24h的菌苔洗下，置于无菌脱脂牛乳中，制成菌悬液，分装于无菌安瓿（每瓶0.1～lml）。用喷灯封瓶口，并将封后的安瓿浸入4℃有色液体中浸30min，明确熔封后再冷冻。冷冻时先将安瓿放入4℃冰箱中1h，移置冰格放lh，再置-30℃～-20℃低温冰箱中冻结30min，然后移置-196℃液氮中保存。使用时，先将从液氮中取出的安瓿浸入30℃～40℃温水中迅速解冻，再打开安瓿，取出菌液接种。在液氮中取放安瓿要防止安瓿爆炸，小心取放。
三、冷冻干燥保存法
冷冻干燥法是先使细菌在极低温中快速冷冻，然后在低温下真空减压，利用升华现象从菌体除去水分，使细菌停止生理活动，其细胞结构和成分保持原来的状态，从而能够长期保存。本法适用于大多数病原微生物的长期保存。
1.冷冻干燥保存法的操作程序增菌培养-悬浮于灭菌保护剂制成菌液-分装于灭菌菌种管→预冷→减压→熔封→真空度检查→保存。
2.具体操作
2.1菌液的准备：按照不同细菌的营养要求和培养条件，先在适当的培养基中作增菌培养，然后移植在保护剂中制成109～1010个/ml细菌悬液。如为固体增菌培养基，可将保护剂注入试管内将斜面上的菌苔洗下，制成菌悬液；如为液体增菌培养基，在培养增菌后，离心。沉淀，倾去上清液，加人保护剂稀释成所需含菌浓度。
2.2保护剂：保护剂的作用是使悬浮于保护剂中的细菌在冷冻干燥过程中保持存活，并在复原时使休止状态的保存菌易于恢复生活发育状态。常用保护剂及其制法如下。
2.2.110％甘油溶液。
2.2.2含牛血清白蛋白的10％甘油溶液：20％甘油1份，0.2％牛血清白蛋白1份，混合后过滤除菌。
2.2.312％蔗糖培养基：取适宜该细菌增殖的灭菌培养基和24％过滤除菌蔗糖溶液等量混合，以无菌手续分装备用。
2.2.410％脱脂乳：在微热的200mL蒸馏水中加入脱脂奶粉20g搅匀，用重叠数层的纱布过滤，分装小试管各5～6ml，1150C高压蒸气灭菌13min。
2.2.5加1％麸氨酸钠的10％脱脂乳：将20％（w/v）脱脂乳和2％麸氨酸钠等量混合，115℃高压蒸气灭菌10min。
2.3菌种管的准备：将球形菌种管或优质玻璃安瓿浸入2％HCl中过夜，取出后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲净，晾干，于160℃干热灭菌2～2.5h，使用时在管壁贴上注明保存的菌种名称、菌号、日期等标签。
2.4分装菌液：在无菌操作下用长针头注射器或毛细吸管，吸取菌悬液分装在菌种管或安瓿内，每管0.1～O.2ml，注意在分装时不要使菌液沾污菌种管颈部，塞好棉塞。
2.5预冷：预冷的目的是使水分在冷冰的状态下升华，以免在真空干燥时菌悬液沸腾外溢。预冷的温度要低，一般在-40℃—-30℃，速度要快，一般2～5min即可冻结，但为使菌液冻结坚固，应预冷l～2h或更长。常用的冷冻剂是在干冰（固体C02）中加入等量的无水乙醇（甲醇或丙醇亦可），混合后一般为-30℃以下，最低可达-72℃。在冷冻槽中放入冷冻剂，将已分装的菌种管插入冷冻剂中，1—2h即可坚固冻结。此外，也可以在液氮或-40℃以下低温冰箱中进行预冷。
2.6真空干燥：可用真空干燥机或用简易的真空干燥装置进行干燥。前者有各种型号，可按说明书的要求进行操作。
简易的真空干燥装置是由真空泵、冷凝器、真空表、干燥器连接而成的真空系统。全部真空系统的所有接头均用熔化的蜂蜡（等量的蜂蜡和松香）密封，并检查有无漏气处。检查时：开动真空泵抽气，5～10min后，若真空表显示的真空度达30mm汞柱，说明密封良好。冷凝器即为装有冷冻剂的容器。
简易真空干燥的操作方法是：在预冷后将冷冻的菌种管迅速移人干燥器内（在干燥器底层应预先放入适量干燥剂，如无水氯化钙或硅胶等）。开动真空泵抽气减压，开始15min内使真空达到0.5mm汞柱，随后逐渐达到0.2～0.1mm汞柱到肉眼可观察到冷冻菌液干燥。由于菌种管数量和真空干燥装置的规格不同，所需要的时间也有较大差异。一般在4—8h。肉眼观察时可根据菌悬液的性状和颜色判断是否达到干燥。菌悬液在干燥后颜色发白，干固而疏松，稍加振动即离开管壁。必要时可在干燥器内放1～3支装有0.1～0.2ml的1％氯化钴牛乳液（预先与菌种管一起冻结）作为干燥指示管。若牛乳变为天蓝或深蓝色，即表示已干燥。
2.7熔封：真空干燥后，从干燥器取出菌种管，连接在封口装置上抽气，在保持真空的状态下，用酒精喷灯在菌种管颈部缓慢加热，逐渐将其拉长、熔封。熔封后应检查其真空度。常用高频电火花检测器进行检测，将通电的仪器尖端轻轻接触菌种管上半部（勿直接射向菌体），使安瓿内真空放电并发出蓝紫色荧光者，表明已达到真空。
2.8干燥样品的保存：通常放在室温下或4℃保存，也可以在低温冰箱中（-25℃）保存。
2.9干燥样品的复苏
2.9.1启封：用酒精棉球消毒菌种管外表，用锉刀或砂轮片在其颈部锉痕，折断封口后要用无菌纱布或脱脂棉包盖颈部，以防止内部干燥病菌逸出，也可防止外部杂菌侵入。但不要用酒精棉球包盖开口，防止酒精进入菌种瓶内。也可用烧红的玻璃棒与割痕接触，菌种瓶颈部产生裂纹，在空气中放置0.5—lmin，使空气徐徐进人瓶内，即可防止病原逸散。
2.9.2复苏：用无菌吸管将适于该种细菌生长繁殖的液体培养基0.3～0.5ml加人安瓿中，缓慢吸吹数次使团块完全溶解，再将其移种在液体培养基和斜面培养基各2～3管。细菌在保存中受到一定损伤，故第一次复苏应选用营养丰富的培养基。例如，加入血液、血清、半胱氨酸等可使存活率提高。
2.10注意事项：在菌液的制备、分装、预冷等过程中必须严格防止污染扩散。全过程所用的各种器械事后必须严格消毒。在真空干燥时应避免水气抽入真空泵的机油内，故应在干燥器与真空泵之间安装冷凝器，其冷凝温度应在-30℃以下。干燥完毕后应先关闭真空泵电源，然后缓慢放入空气，以防止机油被吸人干燥管道内。冻干菌种在启封时容易发生逸散或其他意外污染，故应在无菌罩内启封，并准备好消毒剂，以防万一。启封并移去菌液后的空安瓿（包括捏开的上端和碎片），用镊子收集在一个容器内，121℃高压蒸气灭菌20—30mi。，然后扔掉。致病性特强的病原微生物最好不用冷冻干燥法保存。如用此法保存，操作时须特别谨慎。
第六节细菌的快速鉴定方法
传统的鉴定方法不仅过程繁琐，费时费力，且在结果的判定、解释等方面易发生主观片面而引起错误，难以进行质量控制。
细菌的快速鉴定方法是对微生物的研究采用了物理的、化学的分析方法，借助许多自动化仪器，根据细菌不同的生物学性状和代谢产物的差异，逐步发展起来的微量快速培养基和微量生化反应系统，使原来缓慢、繁琐的手工操作变得快速、简单，并有可能实现自动化和机械化。下面对几种快速鉴定方法作以简单介绍。
一、微生物数字编码分类鉴定法
1.数码分类鉴定法原理细菌数码鉴定的基本要点是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。数据库是由细菌条目组成的，每个条目可代表一个细菌种或一个细菌生物型；有些单靠生化反应无法将属内细菌明确区分的，条目可代表细菌属，可用血清学试验等进一步鉴定。每个条目包括着多种单项生化反应。系统中各种种类的细菌有各自相应的数据库，可鉴定出不同数目的细菌。鉴定即通过试剂条中的生化试验将一种（组）细菌与其他细菌相互鉴别，并用百分率（％）表示每种菌的可能性。
将所得生化反应模式转换成数学模式，可把某种菌的全部生化反应结果快速转录成数字，编成数码检索表，此过程叫编码。经查阅检索表又可将该数字（编码）转化成细菌名称。
编码的原则是将20个生化反应的阴阳性结果的+／-为标志的信息编为一组数字。具体作法是，将全部反应每3个为一组、每个组的第一位反应阳性时记作1，第二位反应阳性时记作2，第三位反应阳性时记作4，各种反应阴性时均记作0。再将每组3个反应得出的3个数字相加成一个数字，结果可能为0～7的任何一个数字。
以APl20E为例，反应条中有20个试验，附加氧化酶试验为21个试验，试验结果应为7位数字。例如，某一待检菌试验结果为5144512，经查阅检索本，数码为5144512的细菌判定为大肠埃希氏菌。
2.数码分类鉴定系统的组成和操作
2.1数码分类鉴定系统的组成：由试剂条（板）、添加试剂及检索工具配套，形成完整的微生物鉴定体系。
2.1.1试剂条：由20个内装生化基质液的小管或反应杯组成。它们是选择识别力最强的生化反应优化组合的。常用的生化反应有发酵试验、同化试验、同化或发酵抑制试验、酶试验及其他传统的生化反应。
2.1.2添加试剂：有些试验经孵育后需添加试剂才能呈现颜色变化。添加的试剂有配套试剂盒或单种试剂。
2.1.3检索工具：检索工具包括鉴定表、编码本和电脑软件，可供人工查阅鉴定结果或由电脑自动处理并报告。
2.2数码分类鉴定的操作程序
2.2.1准备：主要工作有：标本处理，必要时使用运送培养基及进行细菌的分离培养等；预试验，如革兰氏染色、镜检等；菌落的选择，挑选可疑致病菌的特征性菌落。
2.2.2接种：制备细菌悬液，挑取1个或多个菌落，按不同要求用蒸馏水或生理盐水制备细菌悬液，并根据试验条的要求制备成一定浓度的细菌悬液接种。
2.2.3观察及记录结果：接种后的试剂条一般经35℃～37℃孵育18～24h可观察结果。多数试验可用肉眼直接观察颜色变化判定，有些试验需添加不同的试剂后方出现颜色变化，有些试验需在紫外灯下观察荧光现象判定。
2.2.4结果的解释：将生化反应的“+”、“-”结果按3个一组（1、2、4）得出一组7位数的数码，查阅编码本上与之对应的细菌条目即可得出解释。使用电脑分析软件时可手工输入肉眼观察得到的“运算符”结果或用配套的读数仪与电脑联机，“半自动地”得到鉴定的结果。
二、微生物自动鉴定及统计系统
本鉴定方法是应用计算机自动地对系统所完成的鉴定样本及药敏试验等作出统计和组成多种统计学报告，使用者可随时根据需要调出报告。
其工作原理是系统采用数码分类法鉴定。
全系统结构包括充液/封口部件（将制备好的菌悬液的试管和试卡输入完成接种）、读数器/孵箱（直接由计算机控制孵箱，并分别为各试卡读数）、计算机（包括终端和键盘）、打印机、测试卡（即各种试验用途的指示卡）。
主要操作步骤是开机后书写测试卡（即把卡片上要进行的试验项目右上角。处涂黑？），然后把配制好的菌悬液置于试管架上，放接种仓充液接种，输人流行病学和标本资料。待试验完毕（不同细菌所需时间不同，一般3～6h或l0h），卡片完成鉴定和药敏测试后，系统可自动打印实验室报告单。
三、其他快速鉴定方法
1.全自动免疫诊断系统本系统全部由计算机控制自动完成分析全过程。可直接从病人或病兽标本中检测细菌、病毒、弓形体、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。
其基本原理是采用酶联免疫方法并在底物中掺入荧光物质使产生荧光产物-4-甲基7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较，计算出标本值并根据阴性和阳性临界值判断测定标本结果。
主要操作步骤是标本经过前处理后，加入样品孔，放人试剂（随机携带的），从键盘输入病人或病兽样本资料，待测试完成后，系统自动打印出报告。
2.血培养自动化分析主要用于快速和准确地诊断细菌侵入血流时引起的菌血症和败向症。
工作原理是根据细菌生长繁殖时产生二氧化碳CO2），通过各种手段检测细菌生长繁殖时产生的CO2来判断阴阳性。
主要操作方法是无菌采集血液后立即注入装有液体培养基的培养瓶中，放人主机的培养箱中孵育，仪器就会自动检测、处理数据，阳性血培养瓶就被检出。
以上介绍的快速鉴定方法，每种方法都有许多系列的产品（机器系统）作为商品出售，这里不作详细介绍。
