病毒分离与鉴定是病毒性疾病检疫、诊断和流行病学调查的重要方法之一，其主要目的是：对患病的个体或群体进行科学的诊断，以便及时处理；对动物进行检疫，确定是否带有某种病毒病原；对病毒引起的疾病进行流行病学调查、追踪调查或者回顾性调查；对未知新病毒进行分类鉴定等理论研究。
第一节病毒分离样品的实验室处理方法
病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。
一、组织器官样品的处理
1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1～2ml Hank，s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1～2ml继续研磨，逐渐制成10％～20％的悬液；
2.加入复合抗生素（注：Hank，s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液WEN）；
3.以8000r/min离心15min，取上清液用于病毒分离。
二、粪便样品的处理
1.加4g的粪便于16ml Hank，s平衡盐溶液中制成20％的悬液；
2.在密闭的容器中强烈振荡30rain，如果可能则加人玻璃球；
3.6000r/min低温离心30min，取上清液再次重复离心；
4.用450nm的微孔滤膜过滤；
5.加二倍浓度的复合抗生素。然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。
三、无菌的体液（腹水、骨髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品
可不做处理，直接用于病毒分离。
四、样品的特殊除菌处理
样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。
1.过滤除菌可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或200nm孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。
2.离心除菌用低温高速离心机以18000r/min（15.24cm转子）离心20min，可沉淀除去细菌，而病毒（小于lOOnm）保持在上清液中。必要时转移离心管重复离心一次。
3.乙醚除菌对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒、小PNA病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过夜。取用下层水相分离病毒。
4.染料普鲁黄（Proflavin）除菌由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.000lmol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。
五、待检样品中病毒的浓缩
对病毒含量很少的病毒样一般普通方法不易检测或分离出病毒，必须经过浓缩。常用浓缩方法如下：
1.聚乙二醇（PEC）浓缩法将分子量6000的PEG逐步加入经一般处理的样品溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。以3000r/min离心15min，用少量含复俣抗生素的Hank，s平衡盐溶液重悬，必要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。
2.硫酸铵浓缩法将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液中边加边搅拌，置4℃过夜。离心同上。
3.超滤器浓缩法是一种高效率的浓缩方法，特别适合大体积的样品浓缩。
4.超速离心浓缩法以4000r/min（15.24cm）离心60—120min，绝大多数病毒将沉于管底。用少量Hank，s平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法因收高。但仅用于小体积的样品。
六、病毒分离样品脂类物质的去除
有些病毒样品（如组织样品）脂类和非病毒蛋白含量很高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂（如正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等）抽提。方法是将预冷的等量有机溶剂等量加入样品中，强烈振荡后，l 000r/min离心5min，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。
第二节实验动物与病毒分离
一、实验动物在病毒学中的应用
分离病毒，通过实验动物来扩增样品中的病毒，使其能够用普通方法鉴定病毒；病毒感染实验研究，借助感染范围鉴定病毒；繁殖病毒制备诊断抗原或疫苗；病毒的免疫学和血清学试验；制备免疫血清。
二、实验动物的分级国内的实验动物目前分4级。
1.一级实验动物也称普通动物（CV），饲养于开放系统或检疫屏障系统，要求无主要人畜共患病病原体和严重危害动物种群的微生物和寄生虫。
2.二级实验动物也称清洁动物（CCV），饲养于简易屏障系统或屏障系统，要求无一级实验动物应排除的微生物、寄生虫和危害本动物种群的微生物和寄生虫。
3.三级实验动物也称无特定病原体动物（SPF），饲养于隔离系统或屏障系统，要求无一、二级动物应排除的和对动物本身有危害或干扰实验结果的微生物和寄生虫。
4.四级动物也称无菌动物（GF），饲养于隔离系统，要求无可检出的微生物或所有非植入的微生物和寄生虫。
另外还有悉生动物（GN），又称已知病原体动物，是指体内带有的微生物完全明确的动物。悉生动物是由无菌动物衍生而来，此种动物是无菌动物，系人为地将指定的微生物丛投入其体内，按投给微生物的种类又分为单菌（Monoxenie）、双菌（Dixenie）、三菌（Trixenie）或多菌（Polyxenie）动物。
三、实验动物的选择
选择用于分离病毒的实验动物的原则是要确认选择的实验动物的种类、年龄、性别对拟检查的病毒有最高的敏感性。实验动物的级别选择可根据实验性质而定。兽医学上常用于分离病毒的实验动物有家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡胚等，也常用自然易感动物如家畜、家禽等。
四、实验动物的接种
实验动物的接种必须选择对拟检查的病毒最敏感的途径，否则，即使接入大量病毒也有可能造成感染失败。分离不同病毒选择的实验动物及接种途径各有所不同，本节只介绍新生小鼠和鸡胚的常用接种途径。
1.鸡胚羊膜腔或尿囊腔的接种主要用于正黏病毒和副黏病毒的分离和增殖。
1.1选用7～13日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒表面。
1.2从气室上端（一般为大头端）打孔，在观察灯下用带有6号针头的注射器从孔中插入至尿囊腔和（或）羊膜腔中，接种0.1～0.2ml样品。羊膜腔的接种应注意向胚胎方向刺入。刺破羊膜腔的一个证据就是胚胎发生一个突然的运动，然后稍向回抽针，注入样品。每份样品接种3～4枚鸡胚。
1.3用胶带或石蜡封孔，将气室向上放置，孵育于35—37℃。
1.4每日用观察灯观察，弃掉24h内死亡的鸡胚，收集24h以后死亡的鸡胚，或72～120h收集活胚。
1.5羊水和尿囊液的收集：将鸡胚置4℃下2～4h，用碘酒和酒精消毒表面，剥去气室上的蛋壳，用剪刀或镊子撕破壳膜和绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液。吸完尿囊液后，用镊子夹住羊膜，用吸管穿入羊膜腔吸取羊水。
2.绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
2.1选择9～12日龄的鸡胚，用5％石炭酸（不用碘酒消毒，因为酒精溶液可经卵壳吸收，并在绒毛膜上产生病变）进行表面消毒。
2.2在观察灯下选择血管较少的一侧，用电烙铁在卵壳上烙一个烤焦圈，或用自制针头钻（无针尖）沿定位线钻一个直径5mm的圆圈，但不能钻透。用刀片挑起一小片卵壳。另外，在气室上方用针头钻穿另外一个孔。
2.3用一橡皮吸球从气室上的小孔轻吸气使胚内形成负压，使侧面开口处的绒毛尿囊膜下陷。
2.4从侧面的开口用注射器通过壳膜插人约5mm深，将0.05ml的样品滴在下陷的绒毛尿囊膜上。缓慢抽出针头，用胶带将鸡胚上的两个开口全部封住。将气室端向上。于35～37℃孵育。
2.5每日观察接种的鸡胚，弃掉24h内死亡的鸡胚。
2.6绒毛尿囊膜的收获将鸡胚放于卵架上，用碘酒和酒精消毒表面。从气室端剥去卵壳，用镊子夹住绒毛尿囊膜（或先将鸡胚倾入平皿中后，再用镊子夹住绒毛尿囊膜），用剪刀剪下绒毛尿囊膜。将绒毛尿囊膜平铺在平皿中，加入几毫升的Hank，s平衡盐溶液或PBS，置于暗色平面上，以便计数痘斑或病斑。
另外，也可采用简便接种方法，即直接从气室端打破卵壳，用眼科镊撕一小片绒毛尿囊膜上的内壳膜，然后滴加样品溶液。
3.卵黄囊接种法主要用于虫媒披膜病毒、衣原体及立克次氏体等的分离和增殖。
3.1选用5～7日龄鸡胚（此期卵黄囊大，易接种，且有较大的表面积供病原体繁殖），于观察灯下画出气室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，用碘酊和酒精消毒气室端。
3.2用针头钻在气室中央锥一小孔，用带有6号针头的注射器将样品沿小孔刺入约3cm，注人0.1～0.2ml接种物于卵黄囊内，随后用胶带或石蜡封孔。
3.3置孵化箱内继续孵育，每天翻卵2次。弃掉24h内死亡的鸡胚（但东方型和西方型马脑炎可能在接种后15～24h内死亡）。
3.4卵黄囊的收获用碘酒和酒精消毒表面，用镊子去掉气室上的卵壳，用另一把灭菌镊子夹出卵黄囊（黄色容易辨认）放在灭菌平皿中，必要时用生理盐水冲去卵黄。也可将全部内容物倾人平皿中，然后剥出卵黄囊。对某些病毒的分离则要收集全部胚体。
4.鸡胚静脉接种选用5～13日龄鸡胚，在观察灯上标出一根大静脉。常规法消毒后，去除静脉上方的一小块卵壳。滴加一小滴灭菌矿物油于内壳膜上，使其变为透明。用带有4号针头的注射器将样品顺血流方向插入静脉内后注射。注射量为0.025—0.05ml。
5.新生小鼠的几种接种途径新生小鼠对多种病毒易感，是一种很常用的实验动物。一般选择出生24～48h的小鼠。常用以下三种接种途径：
5.1皮下接种法接种量0.1ml/只。
5.2脑内接种法接种量0.03ml/只。
5.3腹腔接种法接种量0.01ml/只。
5.4鼠组织毒的收获接种后每天观察2次，及时发现死亡、麻痹等病症。弃掉24h内死亡的小鼠，收集死亡或出现麻痹等症状的小鼠脑和胴体，制成10％的组织悬液用于诊断、鉴定，或接种适宜的组织细胞，或继续接种小鼠用于其他项目研究。若小鼠无任何症状，应继续盲传2～3代。若仍无任何症状则视为阴性。必要时需盲传3代以上。
第三节细胞培养技术
细胞培养分为单层细胞培养和悬浮细胞培养。单层细胞培养包括静止培养和转瓶旋转培养，使细胞在器皿的表面生长出单层或数层细胞。单层细胞常用来分离和繁殖病毒；悬浮细胞培养，是指细胞悬浮于营养液中繁殖的一种培养方法，它可进行连续培养，便于工业化生产，常用来繁殖病毒生产疫苗。根据细胞株的不同，细胞培养又分为原代细胞培养、继代细胞培养、二倍体细胞培养和传代细胞培养。原代细胞培养，是指直接从组织消化分散的细胞所进行的第一代体外培养；继代细胞是指将原代细胞消化下来还能继续培养的细胞；二倍体细胞是指染色体的数目和形态正常的继代细胞，其中至少有75％细胞的核型与其动物获得的正常细胞核型相同；传代细胞系指癌变的异倍体细胞，其特点是可无限地传代培养。
细胞培养能否应用以及是否成功，主要取决于四方面因素，即培养液、血清、辅助试剂及环境。动物病毒分离主要使用细胞单层，下面介绍常用细胞单层培养方法以及与之有关溶液的配制。
一、细胞培养相关溶液的配制
1.抗生素的配制及使用浓度抗生素的贮存浓度通常为使用浓度的100—200倍。特别是在细胞正常传代时尽量避免使用，或仅用100IU/m1青链霉素。其他抗生素是在做病毒分离、鉴定时，怀疑污染或已出现某种污染时才参考使用。
2.7.5％NaHC03的配制
成分：NaHC0375g，双蒸水1000ml。
制备方法：将NaHCO3溶解在灭菌双蒸水中。用正压滤器除菌。分装于50～100ml灭菌瓶中，盖紧盖子。取1～5ml接于硫乙醇酸盐（T，G）培养基中进行无菌检验。普通冰箱或室温贮存。
3.0.5％酚红的配制
成分：酚红5g，NaOH（0.1mol/L）150ml，双蒸水850ml。
制备方法：逐滴将0.1mol的NaOH加入酚红粉末中，研磨直至完全溶解。加双蒸水至1000m1，分装于100～500m1瓶中。在121℃条件下高压灭菌15min。取1～2ml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于室温或普通冰箱，盖子要盖紧。
4.无钙、镁PBS胰蛋白酶溶液（2.5％）的配制
A.磷酸盐缓冲液（PBS）的配制
甲液：成份：NaCl 8.0g KCl 0.2g，CaCl2·2H200.132g MgCl2·2H200.1g，双蒸水800ml；
乙液：成分：Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，双蒸水200ml；
