同治帝去世后，因生前没有子嗣，西太后力排众议，不顾满族权贵的反对，宣布择立醇亲王奕的长子、自己亲妹妹所生、年仅4岁的载湉为帝，改元光绪。而她与东太后继续以皇太后的身份再度临朝听政。当西太后宣布这一决定时，命令在场的翁同龢、潘祖荫同军机大臣、大学士一起拟旨。翁同龢全力支持西太后再度垂帘听政。
在拟旨中，潘祖荫鉴于明世宗“大礼仪之失”，坚持“必宜明书为文宗祀”，想以此遮断醇亲王奕与光绪的父子关系。翁同龢则提出“必应书为嗣皇帝，庶不负大行皇帝付托”。他们的意见得到了军机大臣、大学士的一致同意而被载入谕旨之中。后来，吏部主事吴可读以西太后未给同治帝立嗣，在蓟州马仲桥自杀，想以死谏来唤起人们的注意及为同治帝立嗣。在处理这个事件中，翁与潘祖荫再次联衔陈奏，以立继大权，操之君上，以及清朝不立太子等为理由，反对为同治帝立嗣。
翁同龢在奏疏搬出了清朝的祖宗家法，来说明西太后不为同治立嗣符合本朝旧制，短短几句话就把吴氏的死谏否定了。由于此事，翁同龢为西太后愈发信任而大加重用。
光绪元年十一月（1875年12月），光绪帝虚龄5岁，两宫皇太后决定给光绪帝择师进学，并很快决定由翁同龢做他的师傅。
两宫皇太后之所以迅速作出这一决定，主要是基于以下考虑：一是翁同龢当初在弘德殿入值时，讲书同治帝很爱听，让他来授读光绪帝，一定“堪称此任”；二是翁同龢不像徐桐、李鸿藻那样“固板守旧”，为人平和，遇事机敏，这样的性格最能与小皇帝处理好关系；三是翁同龢在办理同治帝丧礼和拥立光绪帝两件事上对西太后表现了很大的忠诚，让他主持毓庆宫书房，大可放心。
但是，这项任命对翁同龢来说却是喜忧并俱，激动中感到有一股无形的巨大压力在身上：高兴的是两宫皇太后对自己宠眷不衰，而两度帝师，再造贤君，是一生中难逢的美举；担心的是自己担荷非轻，要把一个5岁的娃娃教育成为一代贤君圣主，真是谈何容易。
光绪二年正月二十二日（1876年2月16日），是光绪帝开蒙第一日。同当年入值弘德殿一样，翁同龢一早就漱洗完毕，坐轿入宫。这次授读的地点在养心殿东暖阁，主要是让光绪帝认字，实际上是学前准备。四月二十一日（5月14日）后，正式移至位于紫禁城斋宫东垣的毓庆宫。如果从这时候算起，到1897年4月书房裁撤为止，翁同龢入值毓庆宫前后长达22年之久。在这22年中，他实际上充当了书房总师傅的角色。夏同善在书房时间未及两年，就外放江苏学政了。此后尽管书房陆续添派了孙家鼐（燮臣）、张家襄（子腾）、松涟（寿泉）、孙诒经（子授）等人，但翁同龢对书房的责任非但未减轻，反而加重了。光绪九年六月（1883年7月）西太后面谕翁同龢：此后“书房汝等主之”，当面把皇帝教育的重任交给他。在22年的授读生涯中，他除了因病及两次请假回籍修墓外，几乎没有离开过书房，因此，对于光绪帝的影响最大，彼此之间的感情也最深。
翁同龢对光绪帝的教育大致分为以下几个阶段：
一、幼儿教育阶段。时间大约两年。当时光绪帝只有六七岁。翁同龢主要安排他认字、写仿、听讲书、读生书、背熟书。课本为《帝鉴图说》《论语》《大学》《孝经》《中庸》《尚书》《唐诗》《千家诗》《千字文》等。这是书房的基础教育阶段。若说遇到什么困难，由于光绪幼小，身体瘦弱，体质差，时常表现出怕背书、厌读书的情绪。因为是皇帝，不同民间寻常人家子弟，不能施行惩罚的办法，只能通过说教、诱导。有一次，孙家鼐曾仿照“起居注”的形式，搞了一本《自省录》，换言之，就是记过簿。将光绪在书房内的表现逐日记在上面，必要时呈给太后看，想以此来约束光绪，让他把书读好。但这一着非但未收到效果，还引发了一场“闹学”风波，光绪干脆“逃”宫，不读了。事后，翁同龢接受这一教训，改用体贴关心的办法，每当光绪表现出不愿读书、情绪不高时，干脆减去读书或背书的次数，提前下课，让太监陪他在庭中散步、休息。光绪有时腹痛不思食，不吃饭就来书房，翁同龢就立即传太监送来点心，并对光绪大加表扬一番。有时从书铺上购买《盘山志》《棉花图》等一些内容健康的图画，呈给光绪看。这样做的效果非常好，光绪不仅心情舒畅，读书勤奋，而且同师傅之间的关系也变得很融洽。
二、少儿教育阶段，相当于今日的小学教育阶段。时间大约有五六年。在这一阶段，翁同龢给光绪开设的课程先后有《礼记》《四书》《六经》《诗经》《左传》《通鉴辑要》《庭训格言》《通鉴辑览》《开国方略》《纲鉴览要》《明史》《皇朝经世文编》等。此外，光绪还学习拉弓、骑射，学习编写短文，学习作诗，师傅选讲经策、折件等。这时，光绪已是十多岁的少年，好奇好动是这一年龄层次的特点。他喜欢拆卸钟表，常常将宫中八音表带到书房内拆卸，以致读书全无心思。他好事模仿：一次张家襄（子腾）无意讲起洋人“以手搏饭”，不用筷子，他感到新奇，回到宫中用膳时竟真的做起来，太后迫问，“则言张师傅说的”，吓得张氏“力白无之”；又有一次，他不知听谁说，“守庚申”，居然加以模仿，一夜在寝宫庭院内坐椅“观星斗”，次日进书房，徙椅而卧，呼呼大睡。翁同龢认为光绪好奇好动是好学、懂事的表现，是对新生事物敏感的反映，是好事，因而及时加以诱导。
三、青年教育阶段，相当于今天的中学教育阶段。时间约有五年。在这一阶段，由于年龄的增长，光绪已经是十五六岁了，加上知识的积累，他的求知欲特别强烈，初步具有一定的自学和判断是非的能力，对于社会政治比较敏感。在这一阶段，翁同龢开设的课程有《吕子实录》《古今学渐》《史记》《孟子》《史鉴》《大学衍义》《东莱博义》《通鉴论》等。另外，为满足光绪读书的欲望，又开列了一批课外阅读书籍，如魏源的《圣武记》《海国图志》，中外史地、出使各国使臣日记、笔述游记，汉译西学著作《普法战纪》《泰西各国新史揽要》，冯桂芬的《校邠庐抗议》等。从内容来看，古今中外皆有，这是清朝开国以来，历代皇帝读书中所没有过的现象。除此之外，光绪还遍觅宫中藏书阅读。如光绪帝曾将道光帝御书房《养正书屋》中收藏的《道德经》《道德真经》《道德经集解》等40多本书找来阅读。一度将乾清宫昭仁殿《天禄琳琅》所庋藏的内府善本书检出浏览，其中有南宋岳珂校刻的“五经”。这些都反映了光绪读书非常广泛。同前两个阶段相比，这一阶段书房教育有一个明显的不同：光绪除了读书、听师傅讲书外，师生还经常结合课本、所读之书，展开讨论，甚至结合当时发生的重大朝政活动学批折件，“聊天下事”，“谈海国风情”，带有鲜明的经世教育色彩，对光绪分析问题能力的培养和政治上走向成熟收益不小。
四、成人教育阶段。光绪婚后，仍坚持到书房读书学习。亲政之后，读书已成为他生活中的重要组成部分。而所读之书往往是为了“亲政”的需要。在这一阶段，翁同龢一面授书，一面搜寻或荐呈有关著作供光绪阅读。所讲之书和所进呈之书大多为“时务书”，据翁同龢日记记载，有陈炽的《庸言》、汤震的《危言》、黄遵宪的《日本国志》、郑观应的《盛世危言》等。戊戌变法前夜，进呈了康有为的《明治变政考》《俄彼得变政记》，李提摩太所译的《时事新论》《列国变通兴盛记》等。有时也指导光绪帝作论，但更多的时候是议论朝政，君臣“造膝独对”。此时的书房已成为光绪帝和翁同龢秘密磋商国家大政的地方，书房教育的色彩大为淡化。因而引起西太后的不满，而于1897年2月下令将书房裁撤。
翁同龢在入值毓庆宫书房期间，对光绪帝的道德品质教育也十分重视。还在启蒙第一日，他就向光绪帝写了“帝德如天”四个方块字，并作了解释。此后，他结合光绪成长过程中发生的各类问题，多次指出“于学以正心诚意为本，勿视为迂谈”，要他“去伪”、“去虚”、“去妄”、“存真”、“存实”、“存正”，对封建政治道德身体力行。一次在丰泽园举行“猎耕”典礼，光绪帝极不严肃，行为举止近似嬉戏，事后翁同龢及时劝诫，指出“一切典礼当从心上出，否则即虚即伪，而骄惰且生矣”。光绪脾气不好，一次动手打了随侍太监。为此翁同龢对他进行严肃劝谏，指出此大为不可。光绪帝听后颇能接受。在政治上，翁同龢一直希望光绪帝能成为清代的一位贤明君主。他曾送给光绪帝一首诗，其中有两句：“敬从光绪当阳日，追溯康熙郅治时”。翁同龢希望光绪能像康熙一样，文武兼治，雄才大略，力挽王朝的颓势，洗刷自第一次鸦片战争以来的民族耻辱，使国家重新振作起来。
为了培养光绪帝，翁同龢可谓呕心沥血，付出了巨大的辛劳。对他在毓庆宫书房教育的功过如何评价？当然不能以西太后在将他革职、开缺的谕旨中所讲的那样，说他“授读以来，辅导无方”，“从未将经史大义，剀切敷陈，但以怡情书画古玩等物，不时陈说”，这是不公正的。事实上，翁同龢在毓庆宫的授读是成功的，这只要将它同弘德殿书房同治帝的教育情况加以比较，就不难得出结论。同治帝直到亲政前，在西太后检查他的学业时，诗无成诵，语不成句，西太后急得几乎哭泣。而光绪在翁同龢及其他师傅的精心教导下，进步很快，除了口吃这一先天不足之外，无论在哪一方面都远远超过当年的同治帝。
光绪性情宽厚，沉毅静穆，知识广博，且不好声色。这一点连西太后当初也不得不承认说：“皇上实在是好学”，“功课好……下书房仍读书并漱芳斋亦不愿去”；甚至在生病之日，也坚持读书“不辍，其勤学如此实非常人所及”。光绪聪明懂事，有奋发向上之志，遇事“自欲振励，勿用人扶”，很想有所作为。光绪帝还流露出亲贤臣、远小人的看法，对百姓的苦难也有同情心，在一首题为《赏菊》的诗中写道：
金英烂漫绕朱栏，佳色清香秀可餐。
不看菊花看稼穑，我知民事甚艰难。
他深居九重，平日足不出宫，之所以对民间疾苦有所了解，显然同翁同龢平日的教育分不开。从某种意义上说，光绪的政治思想倾向就是翁同龢政治思想倾向的反映。光绪帝之所以有所作为，甲午年力主抵抗日本侵略，戊戌年间鼓起立志维新变法的思想风帆，发动轰轰烈烈的维新变法运动，都是同翁同龢突出经世思想的教育分不开的，是翁同龢点燃了光绪帝的改革思想之火。然而翁同龢这种成功教育同西太后所期望的目的正好背道而驰，西太后希望翁同龢将光绪帝培养成绝对顺从她的儿皇帝、政治傀儡，而不是一个有头脑、有独立见解、有政治抱负的君主。因此，翁同龢这样做的结果是不难料到的。西太后的专横不仅给日后光绪帝的“亲政”带来种种厄运，而且也给翁同龢的仕途蒙上了一层阴影。
