从19世纪中叶开始，对气体放电的研究非常盛行。在长玻璃管的两端封入阴、阳两个电极，然后施以高电压，同时用真空把管中的空气抽掉，当空气变得非常稀薄时，管内便闪出淡红色的光，如果进一步把空气抽出，使之几乎变成真空时，淡红色的光消失，而阳极附近的玻璃管壁上则开始闪现出淡绿色的光。
19世纪50年代末，德国的尤利乌斯·普吕克发现，某种射线从阴极射向阳极，碰到玻璃管壁便发出淡绿色的荧光。这种射线被取名为阴极射线。许多人积极地进行研究，但总把握不住它的本质。德国的物理学家一般都把阴极射线看成是同光一样的电磁波。英国的物理学家坚持认为这是粒子流，后来汤姆生证明它确实是电子流。
19世纪90年代中期，德国的菲利普·赖纳特，在玻璃上开一个洞，蒙上铝箔，便发现阴极射线穿透铝箔射向外面。透出的阴极射线碰到涂有铂氰化钡的荧光屏时，就会发出亮光，因此，很容易就知道了它的存在。
第二年，德国的维尔茨堡大学教授威廉·康拉德·伦琴曾采用这种赖纳特的装置研究阴极射线。一天晚上，伦琴为了研究阴极射线的性质，用黑色薄纸板把一个灯管严密地套封起来，并把实验室的百叶窗放下，使室内变得漆黑。在接上高压电流进行实验中，他意外地发现在放电管1米以外的一个荧光屏（涂有荧光物质铂氰化钡的纸屏）上却闪着亮光。一切断电源，荧光就立即消失。这个现象使他非常惊奇，于是他全神贯注地重复做实验。他发现即使在离仪器2米处，屏上仍有荧光出现。伦琴确信，这个新奇现象不是阴极射线造成的，因为实验已证明阴极射线只能在空气中进行几厘米，而且不能透过玻璃管。他决定继续对这个新发现进行全面检验。一连六个星期他都在实验室里废寝忘食地工作着。经过反复实验，他确信发现了一种过去未被人们所知的具有许多特性的新射线。他写的论文中说明了初步发现的X射线的如下性质：（1）阴极射线打在固体表面上便会产生X射线；固体元素越重，产生的X射线越强。（2）X射线是直线传播的，在通过棱镜时不发生反射和折射，不被透镜聚焦。（3）与阴极射线不同，不能借助磁体（即使磁场很强）使X射线发生任何偏转。（4）X射线能使荧光物质发出荧光。（5）它能使照相底片感光，而且很敏感。（6）X射线具有很强的贯穿能力，比阴极射线强得多。它可以穿透千页的书，二三厘米厚的木板，几厘米的硬橡皮等。15毫米厚的铝板，不太厚的铜板、银板、金板、铂板和铅板的背后，都可以辨别荧光。只有铅等少数物质对它有较强的吸收作用，对1.5毫米厚的铅板它实际上不能透过。伦琴一次检验铅对X射线的吸收能力时，意外地看到了他自己拿铅片的手的骨骼轮廓。证明这种光线能够穿透除骨骼以外的人体，并在底片上感光。于是他请他的夫人把手放在用黑纸包严的照相底片上，用X射线照射，底片显影后，看到伦琴夫人的手骨像，手指上的结婚戒指也非常清晰，这成了一张有历史意义的照片。
因为在数学上，未知数习惯于用X表示，所以，伦琴给这种偶然发现的未知的射线取名为X射线，后来科学界称之为伦琴射线。
1896年元旦，伦琴将他的论文和第一批X射线照片复制件分送给一些著名物理学家。几天之后，这个发现就传遍了全世界，在公众中引起轰动。其传播之迅速，反应之强烈，在科学史上是罕见的。伦琴由于发现X射线，于1901年成为第一个诺贝尔物理学奖获得者。
X射线的发现具有十分重大的意义，它是19世纪末20世纪初发生的物理学革命的开端。它的发现对于化学的发展也有重要意义，以X射线晶体衍射现象为基础建立起来的X射线晶体学，是现代结构化学的基石之一。
